南京莫愁湖與紫霞湖浮游細菌群落結構的季節性變化及其與環境因子的關系

曹新益，徐慧敏，王司辰，黃 睿，沈 烽，何肖微，余鐘波，趙大勇

(1.河海大學 水文水資源與水利工程科學國家重點實驗室，江蘇 南京 210098；2.河海大學水文水資源學院，江蘇 南京 210098)

南京莫愁湖與紫霞湖浮游細菌群落結構的季節性變化及其與環境因子的關系

曹新益1，2，徐慧敏1，2，王司辰1，2，黃 睿1，2，沈 烽1，2，何肖微1，2，余鐘波1，2，趙大勇1，2

(1.河海大學 水文水資源與水利工程科學國家重點實驗室，江蘇 南京 210098；2.河海大學水文水資源學院，江蘇 南京 210098)

應用16S rRNA基因末端限制性片段長度多態性(T-RFLP)技術和多元統計方法研究了南京莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構的季節性變化及其與環境因子的關系。結果表明，莫愁湖和紫霞湖的浮游細菌群落alpha多樣性指數在夏季和秋季時最高，在春季和冬季時最低；紫霞湖冬季浮游細菌群落alpha多樣性指數顯著大于莫愁湖。非度量多維尺度(NMDS)分析結果顯示，莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構存在明顯的季節性變化。Mantel檢驗、典范對應分析(CCA)表明，影響莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構最顯著的環境因子是溫度和pH值，營養物對莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構的影響程度取決于湖泊的營養水平。為進一步研究不同程度富營養化水體中的浮游細菌群落結構差異提供了幫助。

莫愁湖；紫霞湖；浮游細菌；群落結構；季節性變化；環境因子；多元統計；末端限制性片段長度多態性技術

莫愁湖是南京市一個重要的景觀類湖泊，近年隨著經濟的發展，其生態環境遭到破壞，水質屬劣Ⅴ類水平[1]，已經呈現較為嚴重的富營養化狀態。莫愁湖富營養化的主要限制因子為氮[2]，近年來采取底泥疏浚、截污等措施，水質有了明顯改善。紫霞湖是位于南京市中山陵風景區的人工蓄水湖泊，外源營養物質補給較少，為典型的低緯度貧營養型湖泊[2-3]。目前，對莫愁湖的富營養化、真核浮游生物、浮游植物、重金屬污染[2，4-6]和紫霞湖的浮游動物、浮游植物、重金屬污染[2，4，7]方面的研究報道較多，但對兩湖浮游細菌群落結構的研究較少。

浮游生物作為水體生態系統中的優勢種，是高等水生動植物賴以生存的重要物質與能量基礎，在生態系統中起著至關重要的作用[8]。浮游細菌是指浮游生物中的原核生物類群，主要包含古細菌、自養細菌和異養細菌[3]。浮游細菌對水體生態系統中食物鏈基本環節的發展有著決定性作用，浮游細菌在水體生態系統中的作用以及影響浮游細菌的環境因素受到研究者的廣泛關注[9]。區域特點和湖泊水體的營養水平均可以影響湖泊浮游細菌多樣性和群落結構的組成，導致水體浮游細菌群落結構的組成發生變化[10]。浮游細菌數量多，在污染物降解和氮磷等營養物循環過程中發揮著重要作用[11]。浮游細菌受外部環境的影響非常顯著[12]，因此，浮游細菌群落結構組成的改變可以在一定程度上反映該水體環境狀態，研究表明浮游細菌在水質調控中起著重要作用[13-14]，目前對于浮游細菌群落在富營養化水體中的分布研究取得了很大進展[15-16]。

研究表明，水體生態系統中的營養鹽既可通過“上行效應”直接對細菌群落的組成和分布造成影響[17-19]，也可通過對水體細菌捕食者的組成和豐度的擾動間接影響水體細菌群落結構和多樣性[20]。目前，越來越多的研究者開始關注浮游細菌與環境因子之間的關系[21-22]，由于浮游細菌與環境因子的關系較為復雜，目前大部分研究仍在摸索階段[23]。Haukka等[24]和Wu等[25]研究發現，在向淡水生態系統中添加營養物質后，浮游細菌的群落結構發生了變化，這種變化可能與水體營養水平的升高有關，這表明淡水湖泊的營養狀態可能是影響浮游細菌群落結構的重要因素。

作為降解者的微生物群落，浮游細菌個體結構簡單，對環境變化敏感，其群落結構組成和多樣性能夠在一定程度上反映水體環境質量狀況[8]，因此，調查年內莫愁湖和紫霞湖中浮游細菌群落結構組成的變化有助于更好地理解其生態系統。邊園琦等[3]對紫霞湖的浮游細菌群落結構進行了研究，但并未研究紫霞湖浮游細菌群落結構的季節性變化；沈烽等[26]應用高通量測序技術對莫愁湖和紫霞湖的浮游細菌多樣性進行了研究，但并未探究浮游細菌群落結構與環境因子之間的關系；Bai等[16]研究了高原湖泊滇池沉積物細菌多樣性，發現沉積物細菌多樣性的分布存在時空差異，并且受季節變化的影響；Ma等[27]研究粵東海水增養殖區浮游細菌數量變化時發現，季節是影響浮游細菌數量的重要因素。季節變化會導致湖泊水體溫度、pH值等環境因子的變化，同時改變浮游植物光合作用強度，導致水體中有機物含量變化[28]。因此，研究湖泊浮游細菌群落結構的季節性變化、探究導致這種變化的影響因子是必要的。

末端限制性片段長度多態性(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)技術是一種新興的分子生物學技術[29-30]，該技術不必進行細菌培養即可進行細菌群落分析[31]，可以有效地應用于微生物群落的對比分析和微生物多樣性分析[32]。自1997年Liu等[33]應用T-RFLP技術研究微生物的多樣性以來，T-RFLP技術已被廣泛應用于土壤[34-36]、植物根系[37]、污水處理[38]、湖泊沉積物[39]、淡水水體[40]等方面的研究。

作者應用T-RFLP技術對南京莫愁湖和紫霞湖一年內四個季節的浮游細菌群落結構進行分析，研究2個湖泊浮游細菌群落結構的季節差異，通過多元統計方法研究浮游細菌群落結構與環境因子的關系，探討影響莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構的關鍵環境因子，擬為莫愁湖和紫霞湖污染水體的生態修復提供理論依據，豐富對城市湖泊水體浮游細菌多樣性、浮游細菌群落結構與環境因子相互關系的認識。

1 實驗

1.1 水樣采集

在2011年1月至2012年1月間，每個季節對莫愁湖和紫霞湖各采集一次水樣，每次采集3～4個平行樣本，采樣點均勻分布在湖區內。

使用采水器采集距水面0.5 m處的水樣1 000 mL，分裝在滅菌藍蓋玻璃瓶中(期間現場測定水樣的溫度及pH值)，密封，避光保存在4 ℃保溫箱中，盡快運回實驗室進行后續處理。

1.2 理化指標分析

1.3 T-RFLP分析

取上述經過0.22 μm濾膜過濾的水樣，參照文獻[39]進行DNA提取。PCR擴增反應采用細菌通用引物對27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和926r(5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′)。PCR反應體系和循環條件參照文獻[41]。擴增體系為50 μL，包含 5×PCR buffer 10 μL、0.25 mmol·L-1dNTP、2.5 mmol·L-1鎂離子、0.2 mmol·L-1上下游引物、10 ng DNA模板、2 U Taq酶，加去離子水至50 μL。擴增程序為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環30次；72 ℃延伸7 min。4 ℃保存，進行下游分析。

PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后使用核酸片段分析儀(CEQ8000型，Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)對酶切產物進行T-RFLP分析，分析時控制堿基長度介于60～600 bp、相對豐度超過1%的片段的末端限制性片段，即T-RFs。按T-RFs占各個樣品的豐度百分比進行標準化，再分別計算每個樣品浮游細菌群落的alpha多樣性指數(Simpson指數和Shannon指數)，以研究水體中浮游細菌群落的多樣性和均一度。

對每組樣品的多樣性指數做anova檢驗，用a、b、c、d分別標注多樣性指數有顯著差異的樣品(P<0.05)。

1.4 alpha多樣性指數分析

采用Shannon(H′)和Simpson指數(D)進行浮游細菌群落的多樣性評價[39]。

(1)

(2)

式中：S為物種總數；Pi為第i個峰面積占總面積的比例，即T-RFs的相對豐度。

1.5 多元統計分析

利用R語言軟件(R programming language,version 3.2.3)中的Vegan軟件包完成如下分析：非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling,NMDS)分析、典范對應分析(canonical correlation analysis,CCA)、envfit分析、Mantel及偏Mantel檢驗、方差分解分析(variation partitioning analysis,VPA)。其中，NMDS分析用于判定不同樣品間浮游細菌群落結構的差異性，CCA用于研究環境因子對浮游細菌群落結構的影響，Mantel及偏Mantel檢驗用于探究環境差異與浮游細菌群落結構差異的相關性，VPA用于研究不同環境因子對浮游細菌群落差異的影響程度。

2 結果與討論

2.1 水樣理化指標分析(表1)

表1 莫愁湖和紫霞湖水樣理化指標分析

Tab.1 Physicochemical parameters of water samples from Mochou Lake and Zixia Lake

依Thomas標準[40]：“富”級：無機氮>1.5 mg·L-1，TP>0.1 mg·L-1；“中-富”級：無機氮0.5～1.5 mg·L-1，TP 0.03～0.1 mg·L-1。從表1可以看出，莫愁湖的TN在4個季節都達到了“中-富”級水平，TP都達到了“富”級水平，而紫霞湖的TN在4個季節都達到了“富”級水平，TP則為“中-富”級水平；2個湖泊的TP在夏季明顯升高(分別達到0.80 mg·L-1和0.10 mg·L-1)，莫愁湖的TP整體上高于紫霞湖；2個湖泊的TN整體而言比較穩定，均在夏季達到最高值(分別達到2.37 mg·L-1和4.78 mg·L-1)，紫霞湖的TN整體上高于莫愁湖。這是因為，莫愁湖作為景觀湖泊，其主要污染源為生活污水和生活垃圾，污染程度更加嚴重；紫霞湖作為風景區的人工蓄水湖泊，污染程度相對較輕。

2.2 alpha多樣性指數分析

根據T-RFLP圖譜結果，分別計算不同季節莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落的alpha多樣性指數，結果如圖1所示。

圖中不同的字母標注表示2個組有顯著性差異(P<0.05，anova檢驗)

從圖1 中Simpson指數(圖1a、c)可以看出，春季莫愁湖和紫霞湖的浮游細菌群落的多樣性均要顯著低于其它3個季節。Shannon指數(圖1b、d)顯示，春季莫愁湖的浮游細菌群落的多樣性要顯著低于夏季和秋季，與冬季無顯著性差異；而紫霞湖浮游細菌群落多樣性要顯著低于其它3個季節，這與沈烽等[26]的研究結果是一致的。

不同季節莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落的alpha多樣性指數對比如圖2所示。

圖中不同的字母標注表示2個組有顯著性差異(P<0.05，T檢驗)

從圖2中Simpson指數和Shannon指數可以看出，莫愁湖和紫霞湖在春季、夏季和秋季的浮游細菌群落多樣性無顯著性差異，冬季的浮游細菌群落多樣性有顯著性差異。這個結果可能與2個湖泊不同的營養類型有關[24]。

2.3 不同季節浮游細菌群落結構差異

通過計算樣品間T-RFLP的距離(Bray-Curtis距離)，采用NMDS分析方法探究不同季節莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構的可能差異，結果如圖3所示。

圖中每一個點表示一個樣品

圖3 不同季節莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構的NMDS分析

Fig.3 NMDS analysis of bacterioplankton community structure of Mochou Lake and Zixia Lake in four seasons

從圖3a可以看出，莫愁湖春季、冬季和夏秋季的點重疊很小，夏季與秋季的點重疊較大，春季與冬季的點則無重疊，表明莫愁湖夏季、秋季的浮游細菌群落結構比較相似，春季、夏秋季和冬季的浮游細菌群落結構有比較顯著的差異。從圖3b可以看出，紫霞湖夏季、秋季和冬季的點相對接近，春季的點相對獨立，表明紫霞湖夏季、秋季和冬季的浮游細菌群落結構比較相似，春季的浮游細菌群落結構與其它3個季節有較明顯的差異。

2.4 浮游細菌群落結構與環境因子的關系

2.4.1 CCA

莫愁湖與紫霞湖的數據CCA排序前四軸最大值分別為2.94和3.92，為了便于比較，因此均使用單峰模型[26]。使用CCA探究環境變量對浮游細菌群落結構的影響，其中環境因子用帶箭頭的直線表示，直線越長則此環境因子與浮游細菌群落結構的相關性越大，直線和排序軸的夾角越小則此環境因子與排序軸的相關性越大。如圖4所示。

圖4 莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構與環境因子的典范對應分析

從圖4可看出，莫愁湖的排序軸1軸和2軸分別解釋了11.27%和9.48%的樣本變異，紫霞湖的排序軸1軸和2軸分別解釋了10.66%和7.30%的樣本變異。

2.4.2 envfit分析

使用envfit分析檢驗每個環境因子的顯著性，結果如表2所示。

表2 環境因子的CCA排序軸的相關性分析

Tab.2 Correlation analysis of CCA ordination axises for environmental factors

注:顯著水平基于1000次置換；***表示P<0.001，極顯著；**表示P<0.01，較顯著；*表示P<0.05，顯著。下表同。

2.4.3 Mantel檢驗

使用Mantel檢驗分析樣品浮游細菌群落結構差異與環境變量差異的相關性。樣品間浮游細菌群落結構差異通過計算Bray-Curtis距離來確定，樣品間環境變量差異通過歐氏距離來確定，結果如表3所示。

表3 浮游細菌群落結構和環境變量的Mantel檢驗

Tab.3 Mantel test for the bacterioplankton community structure and environmental variables

2.4.4 偏Mantel檢驗

偏Mantel檢驗是控制其它變量，分析一個變量與另一個變量的關系。浮游細菌群落結構和環境變量的偏Mantel檢驗結果如表4所示。

2.5 討論

(1)通過T-RFLP技術研究了南京莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構隨季節的變化。alpha多樣性指數分析表明，不同季節湖泊浮游細菌群落的多樣性指數是不同的。莫愁湖和紫霞湖的浮游細菌群落的Simpson指數在春季最低，而在夏季、秋季和冬季差異不大。這一方面是因為夏秋季節湖泊水體中的大型植物和浮游植物大量繁殖，光合作用產生的大量有機物為細菌自由生長繁殖提供了物質基礎；另一方面是因為冬春季水體溫度相對較低，抑制了細菌的新陳代謝和生長增殖速率，而夏秋季則相反[28]。2個湖泊春季、夏季和秋季的alpha多樣性指數沒有顯著性差異，紫霞湖冬季alpha多樣性指數要顯著高于莫愁湖，主要原因可能是：莫愁湖作為景觀湖泊受人類活動影響較大，一年四季均有污水排入[6]，導致莫愁湖一年四季均處在較高的營養狀態；紫霞湖作為人工蓄水湖泊受人類活動影響較小，1月份是枯水期，紫霞湖在此期間山間外來水流入湖泊較少，菌群未能富集，水體的浮游細菌多樣性相應較高，而4月份處于豐水期，在此期間有大量外來水流入湖泊，菌群富集，水體的浮游細菌多樣性相應降低[42]。劉蘭英等[42]對福州左海湖的研究，高程等[43]對北京城區湖泊浮游細菌的研究，邢鵬等[44]、秦伯強等[45]和Wu等[25]對太湖浮游細菌的研究也得到了類似的結論。

表4 浮游細菌群落結構和環境變量的偏Mantel檢驗

Tab.4 Partial Mantel test for the bacterioplankton community structure and environmental variables

(2)采用以Bray-Curtis距離為基礎的NMDS分析探究莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構隨季節的變化。結果表明，莫愁湖浮游細菌群落結構在夏季和秋季差異不大，而春季、冬季和夏秋季的浮游細菌群落結構差異較大，這與沈烽等[26]對太湖浮游細菌群落結構的研究結果是一致的；紫霞湖浮游細菌群落結構在夏季、秋季和冬季差異不大，春季與其它季節差異較大。

(3)運用CCA方法探究莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構與環境因子的關系。結果表明，莫愁湖和紫霞湖的溫度、pH值對浮游細菌群落結構均有著極其重要的影響，營養物有一定影響但不如前兩者，尤其是對于紫霞湖的影響。研究表明，浮游細菌群落結構和多樣性與空間[46]、時間[42-43]、環境變量(如溫度、pH值和營養物)有關[47]，這與本研究結果是一致的。Mantel檢驗結果表明，莫愁湖的溫度差異和pH值差異對浮游細菌群落結構的差異有著極顯著的影響(P<0.001)，莫愁湖的營養物差異的影響顯著(P<0.05)，但紫霞湖的營養物差異的影響并不顯著，這可能與2個湖泊的營養水平不同有關[48]。

研究表明，①在營養水平較低的湖泊中，營養物會通過“上行效應”直接影響水體浮游細菌群落的生長[18-19，49]。②pH值會顯著影響湖泊水體浮游細菌群落結構和多樣性[49-50]，一方面，不同梯度的pH值會不同程度地影響各類細菌的生長狀況(包括絕滅、繁衍、種的形成等[51])，從而直接影響浮游細菌群落結構和多樣性；另一方面，不同的pH值梯度會不同程度地影響湖泊生態系統中的其它環境因子，從而間接影響水體浮游細菌群落結構和多樣性。③溫度對水體浮游細菌群落結構具有選擇作用，是影響湖泊浮游細菌群落結構的關鍵因子之一[52-54]。

本研究中，各采樣點屬于弱堿性環境，適合大部分細菌生長，同時也存在一定的pH值梯度，而溫度在一年內的變化十分明顯，因此會對浮游細菌群落結構有一定的選擇性。

(4)T-RFLP技術具有分析精細、分析能力強、易于自動化、分辨率高和可重復性等優點[55]，被廣泛應用于大范圍長時間尺度的微生物群落結構研究[26]。但若不注意其諸多過程中的技術細節，有可能引起分析誤差，導致無法完全準確地反映環境樣品中細菌群落的結構和多樣性信息。因而為了確保分析結果的真實可靠，在實驗設計時需采用多個具有代表性的重復樣品，使用相同方法重復提取各樣品總DNA，提高分析結果的可靠性[56]。

3 結論

應用16S rRNA基因末端限制性片段長度多態性(T-RFLP)技術和多元統計方法研究了南京莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構的季節性變化及其與環境因子的關系。結果表明，莫愁湖和紫霞湖的alpha多樣性指數在夏季和秋季時最高，在春季和冬季時最低；紫霞湖冬季浮游細菌群落的alpha多樣性指數顯著大于莫愁湖。非度量多維尺度(NMDS)分析結果顯示，莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構存在明顯的季節性變化。Mantel檢驗、典范對應分析(CCA)表明，影響莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構最顯著的環境因子是溫度和pH值，營養物對莫愁湖和紫霞湖浮游細菌群落結構的影響程度取決于湖泊的營養水平。為進一步研究不同程度富營養化水體中的浮游細菌群落結構差異提供了幫助。

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Seasonal Variation of Bacterioplankton Community Structure and Its Relationship with Environmental Factors of Mochou Lake and Zixia Lake in Nanjing

CAO Xin-yi1,2,XU Hui-min1,2,WANG Si-chen1,2,HUANG Rui1,2,SHEN Feng1,2,HE Xiao-wei1,2,YU Zhong-bo1,2,ZHAO Da-yong1,2

(1.StateKeyLaboratoryofHydrology-WaterResourcesandHydraulicEngineering,HohaiUniversity,Nanjing210098,China;2.CollegeofHydrologyandWaterResources,HohaiUniversity,Nanjing210098,China)

Seasonal variation of bacterioplankton community structure and its relationship with environmental factors of Mochou Lake and Zixia Lake in Nanjing were studied by 16S rRNA terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP) technology and multivariate statistical methods.The results showed that,alpha-diversity indexes of bacterioplankton community from Mochou Lake and Zixia Lake were the highest in summer and autumn,and the lowest in spring and winter.The alpha-diversity index of bacterioplankton community from Zixia Lake was significantly greater than that from Mochou Lake in winter.Non-metric multidimensional scaling(NMDS) analysis showed that,bacterioplankton community structure of Mochou Lake and Zixia Lake had a seasonal variation.Mantel test,canonical correlation analysis(CCA) showed the most significant environmental factors which affected the bacterioplankton community structure of Mochou Lake and Zixia Lake were temperature and pH value.Effects of nutrient on bacterioplankton community structure of Mochou Lake and Zixia Lake were depended on the nutrient levels in lake.Overall,this study provides a help to research difference of bacterioplankton community structure in various eutrophic waters.

Mochou Lake;Zixia Lake;bacterioplankton;community structure;seasonal variation;environme-ntal factor;multivariate statistics;terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP) technology

國家自然科學基金資助項目(41371098)，水文水資源與水利工程科學國家重點實驗室專項研究經費資助項目(20145027312，20155019012)，中央高校基本科研業務費資助項目(2015B14214)

2016-07-07

曹新益(1993-)，男，江蘇邳州人，碩士研究生，研究方向：水生態環境保護與修復，E-mail:76565886@qq.com；通訊作者：趙大勇，教授，E-mail:dyzhao@hhu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.12.004

曹新益，徐慧敏，王司辰，等.南京莫愁湖與紫霞湖浮游細菌群落結構的季節性變化及其與環境因子的關系[J].化學與生物工程，2016，33(12)：19-26，30.

Q 178.1 X 172

A

1672-5425(2016)12-0019-08