酪蛋白磷酸肽-鈣絡合物對酸乳發酵特性及微觀結構的影響

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083)

酪蛋白磷酸肽-鈣絡合物對酸乳發酵特性及微觀結構的影響

劉澤朋，祝緣，王婷婷，趙麗麗，毛學英

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083)

本文旨在探究酪蛋白磷酸肽-鈣絡合物（CPP-Ca）對酸乳發酵特性和微觀結構的影響。研究不同添加量CPP-Ca絡合物對酸乳發酵過程中pH值、滴定酸度、乳酸菌數以及酸乳微觀結構和乳清析出率的影響。結果表明，CPP-Ca絡合物的添加可以降低酸乳發酵過程中的pH值，提高滴定酸度；對酸乳發酵過程中的乳酸菌總數沒有顯著影響；增大酸乳蛋白網絡孔徑，提高凝膠結構的連續性和均一性，降低酸乳乳清析出率。

酪蛋白磷酸肽-鈣絡合物；酸乳；發酵特性；乳清析出

0 引言

鈣質缺乏是全球性的營養問題，人們一直在尋找吸收率高的補鈣制劑。傳統的無機鈣鹽和有機鈣鹽由于難吸收，毒副作用大被逐漸淘汰。作為新型鈣營養補充劑，多肽鈣可以被動物體內獨立的小肽轉運系統以較快的速度吸收[1]；大大提高鈣的吸收利用率[2]；且無毒副作用，是較為理想的鈣制劑[3-4]。

酪蛋白磷酸肽（CPP）是來源于牛乳酪蛋白的多肽，具有良好的促鈣吸收效果[5]。研究發現CPP可以提高成骨細胞對鈣的吸收[6]，與鈣離子形成螯合物促進鈣以穩定形式被細胞吸收[7]。

多肽可以為乳酸菌生長提供氮源，酪蛋白磷酸肽-鈣絡合物（CPP-Ca）既有助于酸乳發酵，又能夠起到鈣營養強化的作用。本文研究了CPP-Ca對酸乳發酵及產品特性的影響，為其在酸乳中的應用提供理論基礎。

1 實驗

1.1材料與儀器

1.1.1 實驗材料

脫脂乳粉，直投式發酵劑YF-L812，CPP-Ca（實驗室制備）。

普通化學試劑：氫氧化鈉、鄰苯酸氫二鉀、酚酞、EDTA二鈉、氯化銨、鉻黑T、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、吐溫80、無水乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、一水合硫酸錳、檸檬酸氫二胺、Cys-HCl、瓊脂、氯化鈉等

1.1.2 儀器

恒溫水浴鍋（PK-8B），恒溫水浴振蕩器（DSHZ-300A），立式壓力蒸汽滅菌器（BXM-30R），潔凈工作臺（BBS-SDC），漩渦振蕩器（QL-860），磁力攪拌器（78HW-1），pH計（FE20），電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9076A），激光共聚焦掃描顯微鏡（LSM710）。

1.2實驗方法

1.2.1 酸乳的制作

將CPP-Ca以0，0.5，1，1.5 g/L的質量濃度添加于脫脂乳粉中，混合攪拌均勻，4℃冷藏過夜充分水合。脫脂乳經95℃殺菌5 min后，冷卻至42～43℃，接種1%的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合菌種，在42℃培養箱中發酵至pH值至4.6時到達發酵終點。

1.2.2 pH值的測定

將pH探頭清洗干凈后小心浸入樣品中，使pH計探頭完全浸沒，待讀數穩定后讀取樣品pH值。

1.2.3 滴定酸度的測定

稱取2 g（精確到0.01 g）已混勻的試樣，置于150 mL錐形瓶中，加20 mL新煮沸冷卻至室溫的水，混勻。于溶解混勻后的試樣中加入2.0 mL酚酞指示液，混勻后用氫氧化鈉標準溶液滴定至微紅色，并在30 s內不褪色，記錄消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液毫升數，代入公式進行計算：

式中：X為試樣的酸度（°T）；C為氫氧化鈉標準溶液的濃度（moL/L）；V為滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積，單位為毫升（mL）；m為試樣的質量（g）；0.1為酸度理論定義氫氧化鈉的濃度（mol/L）。

1.2.4 酸乳微觀結構的測定

將CPP-Ca絡合物以0，0.5，1，1.5 g/L的質量濃度添加于脫脂乳中，混合攪拌均勻，水合過夜。經95℃殺菌5 min后，冷卻至42～43℃。然后，按Lucey報道的方法制作酸乳激光共聚焦樣品[8]，在殺菌冷卻后的乳中加入羅丹明B作為熒光蛋白染料，使染料在乳中的最終質量濃度為0.1 mg/mL。添加質量濃度1 g/L發酵劑于乳中并攪拌均勻。取適量樣品（約100 μL）于載玻片凹槽內，蓋上蓋玻片并用硅油密封，發酵至pH值為4.6時結束發酵，置于4℃冷藏。使用Zeiss780倒置共聚焦顯微鏡對酸乳凝膠的微觀結構進行觀察，用Ar/Kr激光束激發出488 nm的波長，在100倍油鏡下觀察不同視野酸乳凝膠的微觀結構。

1.2.5 乳酸菌計數

酸乳樣品以適當比例稀釋后接種于MRS培養基中，37℃培養48 h后進行菌落計數。選擇菌落數30～ 300的平板進行計數，結果以CFU/mL表示。

1.2.6 黏度的測定

取酸乳樣品約8 mL置于10 mL離心管中，發酵完成后使用J-5S型數字式黏度計測定酸乳黏度。

1.2.7 乳清析出的測定

取約10 g酸乳樣品，在4℃下，采用100 g離心力離心10 min，結束后小心吸出上清液，稱重。按照下述公式計算酸乳乳清析出。

式中：m1為離心前樣品與空管的質量（g）；m0為離心去掉上清液后樣品與空管的質量（g）；m2為酸乳樣品的質量（g）。

2 結果與分析

2.1 CPP-Ca對酸乳發酵過程中pH值和滴定酸度的影響

不同添加量的CPP-Ca絡合物對酸乳發酵過程中pH值和滴定酸度的影響分別如圖1和圖2所示。發酵過程中酸乳的pH值隨著CPP-Ca添加量的增加而下降，滴定酸度隨CPP-Ca添加量的增加而升高。當CPP-Ca添加量為1.5 g/L時，酸乳發酵過程中的滴定酸度和pH值分別顯著高于和低于其他樣品。說明CPP-Ca具有促進乳酸菌產酸，降低發酵過程pH值，縮短發酵時間的作用。此外，CPP-Ca對酸乳滴定酸度的影響是在2 h后才出現顯著性差異，說明CPP-Ca對酸度的影響存在滯后現象。隨發酵過程的進行，CPP-Ca可能發生了解離，釋放出游離的鈣離子。體系中隨Ca2+的增加會提高氫離子濃度，降低pH值[9]。因此，在發酵2 h后，酸奶的滴定酸度隨CPP-Ca濃度的增加開始呈現顯著性的提高。

另外，由于牛奶本身含很少量的非蛋白態氮，且嗜熱鏈球菌的蛋白水解能力很弱，因此通過添加酪蛋白水解物CPP增加了發酵體系中肽和游離氨基酸的含量，從而增強了嗜熱鏈球菌的生長和產酸能力[10]。同時由于微生物之間的益生作用球菌的生長過程中產生對保加利亞乳桿菌有益的促生長因子，也有利于嗜熱鏈球菌的生長和產酸。

圖1 CPP-Ca的添加對酸乳發酵過程中pH值的影響

圖2 CPP-Ca的添加對酸乳發酵過程中滴定酸度的影響

2.2 CPP-Ca絡合物對酸乳發酵過程中乳酸菌數的影響

不同添加量的CPP-Ca對酸乳發酵過程中乳酸菌數的影響如圖3所示。由圖3可以看出，隨著發酵時間的延長，添加不同劑量CPP-Ca的樣品乳酸菌數變化趨勢同對照組一致，均呈上升趨勢。發酵至4 h，對照組、CPP-Ca添加量為0.5 g/L、1 g/L的樣品乳酸菌數稍有下降，但與其他樣品組之間無顯著性差異。并且當發酵結束后，各樣品的乳酸菌數也無明顯差異，說明CPP-Ca的添加對酸乳發酵過程中的乳酸菌數沒有顯著影響。而CPP作為酪蛋白水解后的多肽混合物，理論上能為微生物的生長提供氮源，具有促發酵作用[11,12]。但在發酵過程中球菌和桿菌數量比卻可能發生了變化。CPP-Ca濃度的增加，可能促進某一菌株的增加，而抑制了另外一菌株的生長。Oliveira等人[13]研究表明，酪蛋白水解物對不同益生菌菌株的穩定性是不同的。在發酵初期蛋白水解物可能對于水解能力有限的球菌有明顯促生長作用，而對桿菌活菌數沒有顯著的變化。到發酵后期，由于酸度的增加，對酸性更敏感的球菌則可能減少，而桿菌活菌數則上升。

圖3 CPP-Ca的添加對酸乳發酵過程中乳酸菌數的影響

2.3 CPP-Ca絡合物對酸乳微觀結構的影響

不同添加量的CPP-Ca絡合物對酸乳微觀結構的影響如圖4所示。圖4中，A、B、C、D分別代表CPP-Ca添加量為0，0.5，1，1.5 g/L的酸乳樣品。結果顯示，未添加CPP-Ca絡合物時，酸乳蛋白質交聯程度致密，網絡孔隙小，且不連續。隨CPP-Ca添加量的增加，酸乳蛋白凝膠網絡結構呈現網絡孔隙增大，致密性降低，但連續性和均一性增強。當添加量為1.5 g/L，凝膠網絡孔隙最大，連續性和均一性最佳。孔隙的增大利于對乳清進行包裹，防止乳清過度析出。體系中鈣的增加有利于與膠體磷酸根離子結合，形成膠體磷酸鈣，進而可以增加酪蛋白之間的交聯作用[14]，同時，CPP質量濃度的增加也可以與乳清蛋白形成交聯，減少了乳清蛋白和酪蛋白之間交聯形成的致密結構。

圖4 CPP-Ca的添加對酸乳微觀結構的影響

2.4 CPP-Ca絡合物對酸乳乳清析出的影響

不同添加量CPP-Ca絡合物對酸乳乳清析出的影響如圖5所示。由圖5可以看出，隨著CPP-Ca絡合物濃度的增加，發酵乳乳清析出率顯著降低。當CPP-Ca絡合物添加量為1.5 g/L時，乳清析出率最少。

圖5 CPP-Ca的添加對酸乳乳清析出率的影響

體系中鈣質量濃度的增加，可以增加膠體磷酸鈣的形成并與酪蛋白膠束結合，形成連續性較強的膠體網絡結構，提高膠體持水力[9]。因此，CPP-Ca可以提高酸奶中可溶性鈣質量濃度，使膠體網絡結構連續均一，抑制了乳清析出。但體系中鈣的存在形式也會影響酸乳凝膠特性。Ramasubramanian等人[9]比較了離子鈣和非離子鈣對酸乳黏度和硬度的影響，發現游離鈣一定程度會降低酸乳質構特性，而非游離鈣則會在一定程度改善酸乳質構特性。

3 結論

（1）在酸乳發酵過程中，CPP-Ca具有促進酸乳發酵的作用，在相同發酵時間內可以促進乳酸菌產酸，降低pH值，增加滴定酸度。

（2）在酸乳發酵過程中，CPP-Ca的添加對乳酸菌數的變化沒有顯著影響，但可能會影響其比例。

（3）CPP-Ca的添加會增大凝膠結構的孔徑，形成連續性和均一性較強的網絡結構，進而降低了酸乳的乳清析出率。

[1]TSURUKI T,YOSHIKAWA M.Anti-alopecia effect of Gly-Leu-Phe, an immunostimulating peptide derived from α-lactalbumin[J].Biosci?ence,biotechnology,and biochemistry,2005,69(8):1633-1635.

[2]方細娟,曾慶祝,戰宇,等.多肽-金屬元素配合物的研究進展及發展前景[J].食品工業科技,2012,33(4):413-416.

[3]陳華,鐘紅茂,范潔偉,等.國內補鈣產品的研究現狀[J].現代食品與藥品雜志,2007,17(6):57-59.

[4]韓櫻,何慧,趙寧寧,等.蛋清肽-鈣配合物體內促鈣吸收作用研究[J].食品科學,2012,33(11):262-265.

[5]REEVES R E,LATOUR N G.Calcium phosphate sequestering phos?phopeptide from casein[J].Science,1958,128(3322):472-472.

[6]DONIDA B M,MRAK E,GRAVAGHI C,et al.Casein phospho?peptides promote calcium uptake and modulate the differentiation pathway in human primary osteoblast-like cells[J].Peptides,2009,30 (12):2233-2241.

[7]COSENTINO S,DONIDA B M,MARASCO E,et al.Calcium ions enclosed in casein phosphopeptide aggregatesare directly involved in the mineral uptake by differentiated HT-29 cells[J].International dairy journal,2010,20(11):770-776.

[8]LUCEY J A,TEO C T,MUNRO P A,et al.Microstructure,permea?bility and appearance of acid gels made from heated skim milk[J].Food Hydrocolloid,1998a,12(2):159-165.

[9]RAMASUBRAMANIAN L,RESTUCCIA C,DEETH H C.Effect of calcium on the physical properties of stirred probiotic yogurt[J]. Journal of dairy science,2008,91(11):4164-4175.

[10]DAVE R I,SHAH N P.Ingredient supplementation effects on viabil?ity of probiotic bacteria in yogurt[J].Journal of dairy science,1998,81 (11):2804-2816.

[11]LUCAS A,SODINI I,MONNET C,et al.Probiotic cell counts and acidification in fermented milks supplemented with milk protein hy?drolysates[J].International Dairy Journal,2004,14(1):47-53.

[12]MCCOMAS K A,GILLILAND S E.Growth of probiotic and tradi?tional yogurt cultures in milk supplemented with whey protein hy?drolysate[J].Journal of food science,2003,68(6):2090-2095.

[13]OLIVEIRA M N,SODINI I,REMEUF F,et al.Effect of milk sup?plementation and culture composition on acidification,textural prop?erties and microbiological stability of fermented milks containing pro?biotic bacteria[J].International Dairy Journal,2001,11(11):935-942.

[14]OZCAN-YILSAY T,LEE W J,HORNE D,et al.Effect of trisodi?um citrate on rheological and physical properties and microstructure of yogurt[J].Journal of dairy science,2007,90(4):1644-1652.

Effect of casein phosphopeptide-calcium complex on fermentation properties and microstructure of yogurt

LIU Ze-peng,ZHU Yuan,WANG Ting-ting,ZHAO Li-li,MAO Xue-ying
(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083，China)

The effects of casein phosphopeptide-calcium complex(CPP-Ca)on the fermentation and product properties of yogurt were ex?plored.The changes of pH value,titration acidity,lactic acid bacteria count of yogurt which was added CPP-Ca complex were determined. The microstructure of yogurt was observed by confocal laser scanning microscopy.The results indicated that the addition of CPP-Ca com?plex could reduce the pH values,increase the titration acidity,and had no significant difference on the lactic acid bacteria counts during the fermentation.In addition,the addition of CPP-Ca complex increased the diameter size of gel pores and augmented the continuity and uni?formity of the gel structure,which decreased the whey separation of yogurt.

casein phosphopeptide-calcium complex;yogurt;fermentation properties

Q93-33

A

1001-2230（2016）09-0004-03

2016-03-29

中國農業大學本科生科研訓練計劃；現代農業產業技術體系北京市奶牛創新團隊；“十二五”國家科技支撐計劃（2013BAD18B12-05）。

劉澤朋（1994-），男，本科，研究方向為功能性乳制品。

毛學英