山羊乳餅中乳酸菌的多樣性研究

王昱敬，楊海秀，劉雪英，郭潔，黃艾祥

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)a.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院；b.龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院，昆明650201）

山羊乳餅中乳酸菌的多樣性研究

王昱敬a，楊海秀a，劉雪英a，郭潔b，黃艾祥a

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)a.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院；b.龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院，昆明650201）

云南省西北部的劍川縣傳統(tǒng)上有加工羊乳餅的歷史，其產(chǎn)品工藝獨(dú)特，選用的凝乳劑為發(fā)酵酸乳清和貫筋藤浸泡液，乳餅中的乳酸菌資源值得探索。對(duì)采自劍川縣3個(gè)鎮(zhèn)的12份羊乳餅樣品采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)合16S rRNA基因序列進(jìn)行鑒定，并繪制乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，探索進(jìn)化途徑和親緣關(guān)系。乳餅中乳酸菌活菌數(shù)均大于6.0×107g-1，共鑒定42株乳酸菌，分為6個(gè)屬，12個(gè)種和2個(gè)亞種，其中34株桿菌分離株歸屬2個(gè)不同屬中的8個(gè)種，8株球菌分離株歸屬4個(gè)不同屬中的6個(gè)種，Lactobacillus plantarum和Lactobacillus fermentum是優(yōu)勢(shì)菌株，分別占總分離株的30.95%和21.43%。研究結(jié)果有利于乳酸菌資源開(kāi)發(fā)利用。

乳餅；乳酸菌；分離鑒定；16S rRNA基因

0 引言

羊乳餅以鮮羊奶為原料，加熱至80℃左右，添加凝乳劑（發(fā)酵酸乳清和貫筋藤浸泡液），凝乳、排除酸水、壓制成型，其質(zhì)地柔軟、營(yíng)養(yǎng)豐富[1]。

乳酸菌具有調(diào)節(jié)人體腸道內(nèi)菌群平衡、抑制膽固醇吸收，降血脂、降血壓和免疫調(diào)節(jié)[2-5]等益生功能，因此在傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中篩選優(yōu)良益生特性的乳酸菌已成為研究的熱點(diǎn)。劉文俊等[6]對(duì)云南省大理州20份乳扇樣品的乳酸菌多樣性進(jìn)行研究，共鑒定出85株乳桿菌和9株球菌；楊希良等[7]對(duì)云南撒尼地區(qū)乳餅及酸乳清中乳酸菌的鑒定及其生物多樣性研究，共鑒定出73株乳酸菌，其中Lactobacillus plantarum和Weissellaconfuse為優(yōu)勢(shì)乳酸菌，分別占總分離菌株的19.18%和15.07%。本文擬采用凝乳劑為發(fā)酵酸乳清加貫筋藤浸泡液加工工藝的羊乳餅，進(jìn)行乳酸菌的探索研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1材料和儀器

1.1.1 材料

樣品：云南省劍川縣3個(gè)鎮(zhèn)的12份羊奶乳餅，采集信息如表1所示。

1.2.1 主要培養(yǎng)基及試劑

培養(yǎng)基：MRS營(yíng)養(yǎng)肉湯，M17營(yíng)養(yǎng)肉湯。

試 劑：革蘭氏試劑盒，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%過(guò)氧化氫溶液，丙三醇，DNA抽提試劑盒，PCR擴(kuò)增引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD），澳柯瑪超低溫冰箱（DW-86L390），電熱恒溫水浴鍋（XM7D-4000），立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-70A），高速離心機(jī)（HC-2062），數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（HPX-9272ME），漩渦振蕩器（QL-861），光學(xué)顯微鏡（BH200）。

表1 劍川地區(qū)羊乳餅種類來(lái)源

1.4方法

1.4.1 菌落計(jì)數(shù)

菌落總數(shù)的測(cè)定、乳酸菌總數(shù)的測(cè)定、按照《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》中GB/T 4789.2-2010、GB/T 4789.35-2010執(zhí)行。

1.4.2 樣品的分離、純化與初步鑒定

采用傾注法，將已滅菌的0.9%生理鹽水配制一系列的樣品梯度稀釋液，取10-7，10-8，10-9三個(gè)稀釋度。根據(jù)菌落形態(tài)特征，劃線分離純化2～3次后，挑取單菌落于MRS培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，同時(shí)進(jìn)行過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)和菌種培養(yǎng)液pH值測(cè)定，確定純種、革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性的菌株置于-80℃超低溫冰箱中保藏[8-15]。

4.構(gòu)建完善的金融衍生品市場(chǎng)準(zhǔn)入制度。我國(guó)金融衍生產(chǎn)品市場(chǎng)發(fā)展還不成熟，因此實(shí)行審批以控制市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)，這是十分必要的。但是，為了順應(yīng)世界金融發(fā)展趨勢(shì)，提高中國(guó)金融衍生品市場(chǎng)的分量，必須要在審慎監(jiān)管的理念下，完善目前仍有空白、漏洞的市場(chǎng)準(zhǔn)入程序，減少因?yàn)橹贫嚷┒催@樣的低級(jí)錯(cuò)誤帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，要適當(dāng)精簡(jiǎn)衍生品上市的申請(qǐng)環(huán)節(jié)，提高審批效率，給予交易所一定的發(fā)展空間，促進(jìn)本國(guó)金融市場(chǎng)的創(chuàng)新［7］191。例如美國(guó)已經(jīng)建立對(duì)某些現(xiàn)金結(jié)算的期貨和期權(quán)合同審批的快捷通道，申請(qǐng)要求在受理后10天就可以得到批復(fù)，同時(shí)考慮允許交易所在未經(jīng)批準(zhǔn)的情況下上市新合約。

1.4.3 乳酸菌16S rRNA序列鑒定

乳酸菌DNA提取釆用生工生物DNA提取試劑盒，用PCR擴(kuò)增乳酸菌DNA的16S rRNA基因目的的片段，25 uL的反應(yīng)體系，通用引物27F（5’-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTT GTTACGACTT-3’），染色體DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性1 min；56℃退火1 min；72℃延伸2 min；30次循環(huán)；72℃末端延伸10min[16]。PCR產(chǎn)物送到上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，每株菌獲得兩條16S rRNA基因的序列，運(yùn)用DNAStar 6.1軟件包中的SeqMan軟件拼接，獲得約1500 bp的有效序列[17-18]。登陸網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和理化特性確定與比對(duì)的目的基因序列同源性最高的已知分類的菌種。

1.4.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與所測(cè)菌株相對(duì)應(yīng)的16S rRNA基因序列，利用ClustalX 2.0.12進(jìn)行多重比對(duì)，得到同源性相似百分比。再采用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并進(jìn)行1000次重復(fù)的Boot-straps統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1乳餅的乳酸菌

測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 乳酸菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

由表2可以看出，在12份羊乳餅樣品中，有3份乳酸菌落總數(shù)在（6.0～9.3）×107g-1之間，有7份乳酸菌落總數(shù)在（2.1～9.8）×108g-1之間，有2份乳酸菌落總數(shù)為（2.0～8.0）×109g-1之間。這表明劍川羊乳餅中的乳酸菌資源較為豐富,有利于進(jìn)一步的分離鑒定。

2.2分離菌株的理化特性

分離菌株的理化特性如表3所示。由表3可以看出，42株分離株的培養(yǎng)液pH值最小低至4.10，除了一株為4.79外，其余菌株均在4.75以下；全部分離株的菌體革蘭染色均呈陽(yáng)性；過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)僅有1株為陽(yáng)性，其余均為陰性，由菌株形態(tài)學(xué)特征結(jié)合理化特性可鑒定出42株疑似乳酸菌菌株。

2.3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建與分析

選取部分代表性的菌株用Mega 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（如圖1所示）。

圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

由圖1可以看出，菌株DNR2-1和DNR5-1與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus plantarum NRRL B-14768的親緣關(guān)系最近，且同源性達(dá)到99%以上，故被鑒定為L(zhǎng).plan?tarum。菌株DNR3-2和DNR3-6分別與標(biāo)準(zhǔn)菌株weissella confusa JCM 1093和標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactococcus Lactis NCDO 604T的系統(tǒng)位置最接近，且同源性達(dá)到99%以上，故被鑒定為weissella confusa和 L.Lactis。菌株DNR3-5與標(biāo)準(zhǔn)菌株Leuconostoc Luctis ATCC 19256聚為一類，且同源性達(dá)到100%，故被鑒定為L(zhǎng).Luctis。菌株DNR5-4和JHR1-3分別與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacil?lus reuteri JCM 1112，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgari?cus ATCC 11842的距離最近，且同源性達(dá)到100%，故被鑒定為L(zhǎng).reuteri和L.delbrueckii subsp.Bulgaricus。

表3 分離菌株的理化特性

2.4分離菌株種屬

結(jié)合菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和測(cè)定序列比對(duì)情況，對(duì)42株分離株進(jìn)行屬種鑒定，結(jié)果如表4所示。

表4 羊乳餅樣品中42株分離株的屬種鑒定結(jié)果

由表4可以看出，分離自劍川縣12份樣品中的42株乳酸菌鑒定為6個(gè)屬（Lactobacillus，Weissella，Lacto?coccus，Enterococcus，Leuconostoc和Streptococcus）中的12個(gè)種，包括4株Weissella confusa，1株Weissella cibaria，1株Leuconostoc Lactis，1株Lactococcus lactis，9株Lactobacllus fer?mentum，13株Lactobacillus plantarum，1株Lactobacillus para?casei，1株Streptococcus equinus，3株Streptococcus macedonicus，3株Lactobacillus casei，1株Enterococcus faecium，1株Lacto?bacillus reuteri，Lactobacillus plantarum和Lactobacllus fermen?tum，2個(gè)亞種（2株Lactobacillus delbrueckii subsp和 1株Streptococcus gallolyticus）。其中乳桿菌分離率高于乳球菌，這可能是由于羊乳餅樣品在制作過(guò)程中有加熱、蛋白質(zhì)變性的工藝，對(duì)乳球菌的生長(zhǎng)存活不利，使得羊乳餅中的乳桿酸菌數(shù)量較多。

2009年，張宜鳳等[20]從大理州洱源、鄧川等地區(qū)采集的乳扇、乳餅、奶疙瘩及酸漿樣品中分離獲得腸球菌、乳酸乳球菌及同型發(fā)酵乳酸桿菌為主要菌群。2010年，孫志宏等[21]從蒙古國(guó)戈壁阿拉泰、東戈壁等地區(qū)采集自然發(fā)酵牛乳樣品20份，從中分離鑒定出74株乳酸菌，其中發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)和瑞士乳桿菌(L.helveticus)為該地區(qū)自然發(fā)酵牛乳的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。2013年，陳芝蘭等[22]研究了西藏不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中乳酸菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)了明串珠菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、片球菌屬及乳球菌屬，其中乳桿菌屬的數(shù)量最大，干酪乳桿菌為主要優(yōu)勢(shì)菌群。對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離出的乳酸菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌因環(huán)境和制作工藝不同，其種類和數(shù)量等存在較大差異。

3 結(jié)論

云南省劍川縣傳統(tǒng)羊乳餅中蘊(yùn)含著豐富多樣的乳酸菌資源，是我國(guó)乳酸菌研究和資源開(kāi)發(fā)的一個(gè)天然寶庫(kù)。乳酸菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果均在6.0×107g-1之上，表明劍川羊乳餅中的乳酸菌資源較為豐富；12份羊乳餅采用16S rRNA基因序列分析技術(shù)和傳統(tǒng)理化特性研究相結(jié)合共鑒定出42株乳酸菌，分為6個(gè)屬，12個(gè)種和2個(gè)亞種，其中Lactobacillus plantarum和Lactobacllus fermentum是劍川羊奶乳餅樣品中的優(yōu)勢(shì)菌株，劍川地區(qū)的乳酸菌種類與其他地區(qū)相比較具有明顯的差異性，這可能與當(dāng)?shù)厣窖蛉轱灥闹谱鞴に嚒夂颦h(huán)境和地理位置等因素有關(guān)。本研究為認(rèn)識(shí)云南劍川地區(qū)的乳酸菌屬種提供一定的理論依據(jù)，為今后研究和開(kāi)發(fā)利用乳酸菌資源提供參考。

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Diversity of Lactic Acid Bacteria in goat dairy cake

WANG Yu-jinga,YANG Hai-xiua,LIU Xue-yinga,GUO Jieb,HUANG Ai-xianga
(Yunnan Agricultural Universitya.College of Food Science and Technology；b.College of Pu-erh tea,Kunming 650201,China)

Jianchuan,Yunnan has a long history of making a unique type of goats'milk cake.The milk coagulant used in the dairy cakes are of the soak solution of fermented acid whey and Dregea sinensis Hemsl.var.corrugate,whose lactic acid bacteria are of great value to explore. For 12 shares of goat dairy cakes from three towns in Jianchuan County had identified by adopting traditional culture methods of coupled with 16S rRNA gene sequence,and phylogeny trees of lactic acid bacteria are drawn out to explore their evolutionary pathways and genetic relationships.The LAB counts in cheeses were greater than 6.0×107g-1.42 strains of lactic acid bacteria are identified in the experiment,con?sisting of 6 genus,12 species and 2 sub-species,among which 34 strains of bacillus isolates affiliate to 8 species of 2 genus,and 8 strains of coc?cus isolates belong to 6 species of 4 genus,Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum are dominant strains,accounting for 30.95%and 21.43%of the total isolates,respectively.The results of the study is beneficial to resources development and utilization of LAB.

dairy cake;Lactic acid bacteria;Isolation and identification;16S rRNA gene

TS252.56

A

1001-2230（2016）09-0020-04

2016-03-28

云南省現(xiàn)代奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（2015KJTX008）；云嶺產(chǎn)業(yè)技術(shù)領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（云發(fā)改人事（2014）1782號(hào)）。

王昱敬（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚Y源與乳品科學(xué)。

黃艾祥