山柰醋炙前后對甲氧基肉桂酸乙酯含量與抗感染鎮(zhèn)痛作用變化研究

吳艷婷,陳桂添,時軍,郭嘉俊

(廣東藥科大學 中藥學院,廣東 廣州 510006)

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天然藥物化學

山柰醋炙前后對甲氧基肉桂酸乙酯含量與抗感染鎮(zhèn)痛作用變化研究

吳艷婷,陳桂添,時軍,郭嘉俊

(廣東藥科大學 中藥學院,廣東 廣州 510006)

目的 比較山柰醋炙前后水提物和醇提物的抗感染鎮(zhèn)痛作用差異,同時測定提取物中對甲氧基肉桂酸乙酯的質量分數(shù)。方法 采用HPLC法測定對甲氧基肉桂酸乙酯質量分數(shù),采用熱板法和二甲苯致小鼠耳廓腫脹法對比山柰提取物的抗感染鎮(zhèn)痛作用。結果 山柰各提取物中對甲氧基肉桂酸乙酯質量分數(shù)大小順序為醋炙醇提物>生品醇提物>醋炙水提物>生品水提物。與生理鹽水組比較,山柰提取物均能顯著抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹度(P<0.01),能不同程度地提高小鼠的痛閾值(P<0.05或P<0.01)；醋炙醇提物組的抗感染鎮(zhèn)痛作用均高于生品水提物組(P<0.05)。結論 醋炙后，山柰提取物中對甲氧基肉桂酸乙酯質量分數(shù)顯著增加,抗感染鎮(zhèn)痛作用增強,對甲氧基肉桂酸乙酯可能是山柰抗感染鎮(zhèn)痛作用藥效成分之一。

山柰； 醋炙； 抗炎鎮(zhèn)痛； 高效液相色譜法

山柰系姜科山柰屬植物山柰KaempferiagalangaL.的干燥根莖,作為一種藥食同源的傳統(tǒng)中藥,性辛、溫,有溫中化濕、散寒、行氣止痛、除濕辟穢的功效,主治胸脘脹滿、心腹冷痛、寒濕吐瀉、消化不良、風蟲牙痛、風濕關節(jié)痛、跌打損傷等證[1-3]。現(xiàn)代研究表明,山柰中主要含有揮發(fā)油[4-6]、山柰酚[7]等活性成分。2015年版《中國藥典》規(guī)定山柰含揮發(fā)油不得少于4.5%。對甲氧基肉桂酸乙酯是山柰揮發(fā)油中的主要有效成分之一,具有鎮(zhèn)痛、抗感染、抗癌、抑菌、防曬等作用[8]。

中醫(yī)理論認為,醋炙能引藥入肝,具有疏肝散癖活血、理氣止痛的作用[9]。李時珍《本草綱目》記載：“治療心腹冷痛,山柰、丁香、當歸、甘草等份,為末,醋糊丸梧子大。每服三十丸,酒下,集簡方[10]。”此外,民間多用川芎與山柰醋炙后治療膝關節(jié)骨質增生,療效良好[11-12]。本文通過比較山柰醋炙前后的鎮(zhèn)痛抗感染效果,考察醋炙前后對甲氧基肉桂酸乙酯質量分數(shù)的變化,歸納總結其量效關系,以期為醋炙山柰的抗感染鎮(zhèn)痛應用提供科學理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DIONEX Ulti Mate 3000高效液相色譜系統(tǒng)(賽默飛世爾科技中國有限公司)；RE-2000A型真空旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHE-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；202-2AB型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；PHS-25型酸度計pH計(上海雷磁儀電科學儀器有限公司)；BP211D型萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

山柰藥材(安徽歸然藥業(yè)有限公司,批號20160103,經廣東藥科大學中藥學院馬鴻雁副教授鑒定為姜科植物山柰KaempferiagalangaL.的干燥根莖)；對甲氧基肉桂酸乙酯對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號110835-201202,質量分數(shù)>98%)；老陳醋(山西四眼井釀造實業(yè)有限公司,批號20150910,總酸質量濃度以乙酸計≥5.00 g/100 mL)；對乙酰氨基酚片(成都德通藥業(yè)有限公司,批號20150806)；甲醇(色譜純,Merk KgaA)；二甲苯、冰乙酸、乙醇等均為分析純,水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級KM小鼠,體質量(20±2)g,雌雄不分,由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,許可證號SCXK(粵)2016-0002。

2 方法與結果

2.1 山柰提取物的制備

取山柰飲片適量,根據(jù)2015年版《中國藥典》醋制規(guī)范,每100 kg凈山柰藥材加入老陳醋20 kg,拌勻,悶潤至醋被吸盡后,置炒制容器內,用文火加熱炒干,取出放涼,即得山柰醋炙品。取山柰生品、山柰醋炙品各適量,粉碎成粗粉,過1號篩,分別以10倍量的蒸餾水和70%(體積分數(shù))乙醇為溶劑,冷凝回流提取3次,前2次回流2 h,第3次回流1 h,趁熱抽濾后合并濾液,減壓回收水和乙醇至浸膏狀。生品水提組、生品醇提組、醋炙水提組、醋炙醇提組的得率分別為62.64%、18.77%、54.58%、28.63%。將所得山柰提取物密封,置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 山柰提取物中對甲氧基肉桂酸乙酯的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-質量分數(shù)0.5%(pH=2.3)磷酸水溶液(體積比60∶40)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃,進樣量：20 μL。在此條件下,對照品溶液、供試品溶液的色譜圖見圖1,對甲氧基肉桂酸乙酯的保留時間為(26.35±0.05)min,表明方法專屬性強,其他物質無干擾。

2.2.2 對甲氧基肉桂酸乙酯對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒質量的對甲氧基肉桂酸乙酯對照品2.47 mg,置5 mL量瓶中,加50%(體積分數(shù),下同)甲醇適量,超聲30 min溶解,加50%甲醇定容至刻度,搖勻,0.22 μm微孔濾膜濾過,配制成質量濃度為494 μg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取各組別的總浸膏0.50 g,置于10 mL離心管中,加入50%甲醇適量超聲(功率70 W,溫度50 ℃,時間20 min),3 000 r/min離心30 min,收集上清液移至25 mL容量瓶中,加50%甲醇定容,搖勻,過0.22 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

2.2.4 方法學考察 精密量取“2.2.2”項配制的對甲氧基肉桂酸乙酯對照品溶液,用50%甲醇稀釋成濃度分別為4.94、9.88、14.82、19.76、29.64、34.58、39.54 μg/mL的系列標準樣品濃度,在上述色譜條件下重復進樣3次,測定峰面積,以峰面積平均值為縱坐標、質量濃度為橫坐標進行線性回歸,得線性方程為Y=1.367 7X+0.062 23,r=0.999 5,結果表明對甲氧基肉桂酸乙酯在4.94～39.54 μg/mL之間具有良好的線性關系。日內精密度、日間精密度、重復性、24 h內穩(wěn)定性試驗的RSD分別為0.13%、0.15%、0.39%、0.55%,表明儀器的精密度和重復性良好,樣品在24 h內穩(wěn)定性良好。樣品中對甲氧基肉桂酸乙酯的平均回收率為98.96%,RSD=0.72%(n=6),表明樣品的回收率符合要求。最小檢測限為12.37 ng/mL,信噪比(S/N)約為3∶1。定量限為98.50 ng/mL,信噪比(S/N)約為10∶1。

t/min200150100500-501751257525-201-26.3971-26.3221-26.3651-26.4001-26.288250200150100500-5010152025303505BACEDmAUmAUmAU

A.對甲氧基肉桂酸乙酯對照品; B.生品水提物樣品;C.生品醇提物樣品; D.醋炙水提物樣品; E.醋炙醇提物樣品。

圖1 山柰中對甲氧基肉桂酸乙酯的HPLC

Figure 1 HPLC chromatograms of Ethylp-methoxy cinnamate inKaempferiaRhizoma

2.2.5 樣品的測定 取各組別的總浸膏0.50 g,精密稱定,按“2.2.3”項下方法處理,依上述色譜條件分別測定3次,記錄峰面積,取平均值，結果測得生品水提組中對甲氧基肉桂酸乙酯的質量分數(shù)為(2.601 3±0.07)μg/g，生品醇提組為(33.541 1±1.9)μg/g，醋炙水提組為(6.109 4±0.6)μg/g，醋炙醇提組為(62.861 9±1.5)μg/g。可見，經醋炙后，山柰提取物中對甲氧基肉桂酸乙酯的質量分數(shù)明顯增加。

2.3 小鼠的抗感染鎮(zhèn)痛試驗

2.3.1 小鼠熱板法的鎮(zhèn)痛試驗 取健康昆明種雌性小鼠,將智能熱板儀溫度調至(55±0.5)℃,預熱10 min后,將雌性小鼠每次1只放在熱板上,小鼠自放上至出現(xiàn)舐左后足所需時間作為該鼠的痛閾值,將篩選合格(舔足時間在5～30 s)的雌性小鼠100只,分10組,每組10只,分別為生理鹽水組(0.2 mL/10 g)、對乙酰氨基酚陽性對照組(58 mg/kg),生品水提組、醋炙水提組、生品醇提組、醋炙醇提組各分別設高、低劑量組(按生藥計為1 750、875 mg/kg)。每組給藥前重復測定痛閾值,取2次痛閾平均值作為正常痛閾值。適應性喂養(yǎng)3 d后給藥,按不同組別進行相應藥物灌胃,每天1次,連續(xù)給藥7 d。末次給藥后分別于30、60、90 min測量小鼠的痛閾值,計算各組給藥后的痛閾提高百分率,結果以SPSS22進行組間t檢驗,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

結果見表1。可見,對乙酰氨基酚、山柰提取物均能不同程度地提高熱板法疼痛模型小鼠痛閾值、減少疼痛反應次數(shù),鎮(zhèn)痛效應與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；醋炙醇提組的鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于生品水提組(P<0.05)；生品水提組在90 min時,痛閾值提高百分率無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3.2 二甲苯致小鼠耳廓腫脹法的抗炎試驗 取健康昆明種小鼠100只,雌雄各半,分10組,每組10只,分組及給藥方式同“2.3.1”項。于末次給藥0.5 h后,將0.02 mL二甲苯均勻涂于每只小鼠右耳耳廓兩面致炎,左耳不涂作為正常對照。1 h后脫頸處死,沿耳廓基線剪下雙耳,用直徑8 mm打孔器取左右耳同一部位圓耳片,用電子天平稱定質量,以右耳質量減去左耳質量為腫脹度,計算耳腫脹度及腫脹抑制率。結果以SPSS22進行組間t檢驗,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

結果見表1。可見,對乙酰氨基酚、生品水提組、生品醇提組、醋炙水提組、醋炙醇提組對二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹均有明顯的抑制作用,二甲苯誘發(fā)耳廓腫脹度與生理鹽水組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。醋炙醇提高劑量組與生品水提低劑量組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01),即醋炙醇提取物比生品水提取物的抗感染作用更明顯,表明醋炙能增強山柰的抗感染作用。

表1 山柰不同提取物的抗感染鎮(zhèn)痛作用比較

與生理鹽水組比較：*P<0.05,**P<0.01；與生品水提物低劑量組比較：▲P<0.05,▲▲P<0.01。

3 討論

揮發(fā)油類和黃酮類成分是山柰中公認的有效成分，但具體的抗感染鎮(zhèn)痛成分目前尚未完全明確[13-14]。前期研究發(fā)現(xiàn),對甲氧基肉桂酸乙酯是山柰揮發(fā)油中質量分數(shù)最高的特征性成分,具有抗感染、鎮(zhèn)痛、抗癌、防曬等藥理活性,是山柰藥材質量控制的指標性成分[15],因此選擇對甲氧基肉桂酸乙酯作為本文的考察指標[15-16]。

本文研究結果表明,山柰經醋炙后,提取物中對甲氧基肉桂酸乙酯的質量分數(shù)明顯增加,抗感染及鎮(zhèn)痛作用增強。醋炙醇提物中對甲氧基肉桂酸乙酯的質量分數(shù)最高，且抗感染及鎮(zhèn)痛作用強度與對乙酰氨基酚相當，量效關系良好。原因可能是,醋炙后山柰中的黃酮類和揮發(fā)油類成分與醋酸結合成更易溶出的可溶性醋酸鹽，醋酸促進部分糖苷類成分水解成具有抗炎鎮(zhèn)痛活性的苷元；對甲氧基肉桂酸乙酯易溶于乙醇等有機溶劑而難溶于水。本文結果進一步闡明了中藥炮制理論的科學性與合理性,驗證了對甲氧基桂皮酸乙酯是山柰抗炎鎮(zhèn)痛的主要藥效物質基礎,為后續(xù)山柰的炮制和提取工藝優(yōu)化研究奠定了基礎。

本文比較了流動相為甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.2%磷酸水、甲醇-0.3%磷酸水、甲醇-0.5%磷酸水,有機相與水相體積比(80∶20,60∶40,52∶48,30∶70),柱溫分別為25、30、35 ℃時的色譜圖。結果表明,流動相為乙腈-水、甲醇-0.5%磷酸水時,色譜基線較穩(wěn)定,峰的分離度大,峰形良好；有機相與水相體積比為60∶40時,對甲氧基肉桂酸乙酯的保留時間適中,在3個柱溫條件下對甲氧基肉桂酸乙酯的出峰情況無明顯差異。綜合實際情況考慮,以流動相為甲醇-質量分數(shù)0.5%(pH=2.3)磷酸水溶液(體積比60∶40),檢測波長為280 nm,柱溫為25 ℃作為液相色譜條件。本文建立了對甲氧基肉桂酸乙酯的測定方法,經方法學驗證精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好(RSD<2%)。該方法定量準確、專屬性強、回收率高,適用于山柰中對甲氧基肉桂酸乙酯的含量測定[17]。

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(責任編輯：陳翔)

Study on the effects of anti-inflammatory and analgesic and the determination of EPMC from Kaempferia Rhizoma before and after vinegar processing

WU Yanting,CHEN Guitian,SHI Jun,GUO Jiajun

(SchoolofTraditionalChineseMedichine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective To compare the effect of different processing technique on analgesic and anti-inflammatory inKaempferiaRhizoma,and to establish a method for the determination of Ethylp-methoxy cinnamate (EPMC). Methods The HPLC method was used for the determination of EPMC. Xylene induced ear swelling and hot plate test were adopted to observe anti-inflammatory and analgesic effects. Results The content of EPMC in different processed products ofKaempferiaRhizomawas as follows: the alcohol extracts from vinegar-processedKaempferiaRhizoma>the alcohol extracts from cleansingKaempferiaRhizoma>the water extracts from vinegar-processedKaempferiaRhizoma>the water extracts from cleansingKaempferiaRhizoma. All the four extracts ofKaempferiaRhizomahad obvious analgesic and anti-inflammatory effects compared to NS group (P<0.05 orP<0.01),but the alcohol extracts from vinegar-processedKaempferiaRhizomawere better than the water extracts from cleansingKaempferiaRhizoma(P<0.05). Conclusion The higher content of EPMC and stronger analgesic and anti-inflammatory effects were observed in the vinegar-processedKaempferiaRhizoma. EPMC might be the effective part on analgesic and anti-inflammatory.

KaempferiaRhizoma; vinegar processing technology; analgesia and anti-inflammatory; HPLC

2016-08-05

廣東藥科大學創(chuàng)新強校項目(廣東省高校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃資助類別，2015cxqx209)

吳艷婷(1993—),女,2016級中藥學碩士研究生,Email：13437871411@sina.cn；通信作者：時軍(1980—),男,副教授,主要從事中藥新藥及制劑新技術研究,電話：020-39352169,Email：shijun8008@163.com。

時間：2016-11-24 16:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161124.1600.001.html

R283.3

A

1006-8783(2016)06-0679-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016080503