3種直接性染發劑染料的生物安全性研究

金淑芳，胡勇，孫各琴，王夏虹，黃玉敏，程鎮烽，趙平,潘育方

(1.廣東藥科大學 醫藥化工學院，廣東 中山 528458; 2.廣東省化妝品工程技術研究中心，廣東 中山 528458; 3.廣東藥科大學 食品科學學院，廣東 中山 528458; 4.中山大學中山附屬醫院 檢驗中心，廣東 中山 528400)

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3種直接性染發劑染料的生物安全性研究

金淑芳1,2，胡勇3，孫各琴4，王夏虹1，黃玉敏1，程鎮烽1，趙平1,2,潘育方1,2

(1.廣東藥科大學 醫藥化工學院，廣東 中山 528458; 2.廣東省化妝品工程技術研究中心，廣東 中山 528458; 3.廣東藥科大學 食品科學學院，廣東 中山 528458; 4.中山大學中山附屬醫院 檢驗中心，廣東 中山 528400)

目的 探討藏紅T、堿性品紅和堿性藍26這3種直接性染發劑染料對人體健康和人類居住環境是否存在潛在毒性。方法 采用透皮吸收、紅細胞溶血、大腸埃希菌毒性測試、NIH/3T3細胞抑制率研究毒性情況，光譜學方法配合分子模擬方法研究其與生物大分子牛血清白蛋白的相互作用情況。 結果 在我國2015年《化妝品衛生規范》允許的濃度下，藏紅T與堿性品紅在48 h后的透皮吸收分別達到0.023 mmol/L和0.010 mmol/L。3種染發劑將導致紅細胞溶血(LD50達到0.16～0.23 mmol/L)、抑制大腸埃希菌(LD50達到0.64～3.77 μmol/L)和NIH/3T3細胞的存活率(LD50達到2.32～22.77 μmol/L)，并與牛血清白蛋白細胞內生物大分子有較強的相互作用。 結論 這3種直接性染發劑對人類的健康和居住環境有潛在性威脅。

直接性染發劑； 溶血效應； 毒性效應； 牛血清白蛋白

(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Zhongshan528458,China；2.GuangdongCosmeticsEngineering&TechnologyResearchCenter,Zhongshan528458,China； 3.SchoolofFoodandScience,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Zhongshan528458,China； 4.DepartmentofExaminationMedicalCenter,ZhongshanAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan528400,China)

直接性染發劑是可以直接使用、劑型使用范圍廣并適合家庭使用的一類染發劑。一直以來，直接性染發劑與癌癥是否存在密切的聯系一直備受爭議[1-5]。流行病學認為，由于許多直接性染料裂分后可能形成毒性芳香族化合物，使用直接性染發劑可能會引起癌癥或者不良反應[6-7]，但目前這方面的理論研究還很不充分[8]。與此同時，歐盟第七次化妝品規程修訂案也頒發了禁止動物體內的遺傳毒性測試[9]，尋找針對化妝品原料的新的體外毒性安全性測試方法也成為亟待解決的問題。

堿性品紅(FB)、堿性藍26(VBB)和藏紅T(BR2)是在直接性染發劑中廣泛使用的3種染料(結構見圖1)[10-11]。本文在2015年《化妝品衛生規范》允許使用的劑量下，分別對這3種染料進行了透皮吸收、溶血效應、大腸埃希菌(E.coli)和小鼠纖維母細胞(NIH/3T3)的毒性效應的研究。其中，NIH/3T3細胞屬于小鼠胚胎成纖維細胞系，已被運用于藥物對人類皮膚的毒性研究[12-13]，盡管如此，但尚無分子水平上的相關研究報道。為了更好地研究這些染料的細胞毒性，本文在分子水平上對這些染料與生物大分子牛血清白蛋白(BSA)進行了光譜試驗和理論模擬研究。

圖1 3種染料染發顏色及分子結構式

Figure 1 The hair colors and molecular structures of three direct hair dyes

1 材料與方法

1.1 材料

牛血清白蛋白(BSA)購于上海生物工程有限公司；所有的染料購買于北京耦合科技有限公司；大腸埃希菌菌株E.coli( MTCC 1678)用作野生菌株；新鮮人體血液樣品由中山市人民醫院提供；PBS(pH 7.4)緩沖液是由10 mmol/L K2HPO4/KH2PO4,40 mmol/L KCl,100 mmol/L NaCl組成；豬的透皮吸收通過體外擴散池進行測試，豬腹部皮毛用電剪刀輕輕刮去以免造成損傷；紫外光譜通過日立U-3900H紫外分光光度計測試；熒光光譜在室溫下通過PerkinElmer L55熒光分光光度計測試；細胞活力通過酶標儀(model 680,Bio-Rad,USA)測試。

1.2 方法

1.2.1 透皮吸收試驗 采用離體的豬腹部皮膚，通過自行設計的流通池(圖2)對透皮吸收情況進行實時性檢測，透皮面積為0.64 cm2。在2015年版《化妝品衛生規范》中染發劑染料堿性品紅的最大使用濃度為0.3%，與氧化物共同使用時最大允許使用量為0.15%；堿性藍26的最大允許使用量為5%，與氧化物共同使用時最大允許使用量為0.25%；藏紅T是最近幾年新出現的一種新型染發染料，依據以上2種染料考慮，考察的最大允許使用濃度為0.4%，與氧化物共同使用時最大允許使用量為0.2%。所有測試每8 h取樣1次。紫外分光光度計測試吸收的染料吸光度。

1.2.2 染發劑染料的溶血效應 健康成人血樣由病理中心收集在抗凝血管中，5 000 r/min離心5 min，移除血清和血漿，然后在37 ℃下將不同濃度的染料與人類紅細胞(RBC)樣品(用PBS制成質量分數為10%)混合培養30 min。0.1%Triton X-100作為陽性對照。培養一段時間后，紅細胞樣品在5 000 r/min下離心10 min，取上層清液在540 nm進行紫外測試。溶血率按“溶血率= [At-Ac/A100%-Ac]×100%)”計算，式中：At是紅細胞與染料相互作用后的上層清液吸光度；Ac是PBS上層清液的吸光度；A100%是0.1%Triton X-100與紅細胞相互作用后引起紅細胞全部破裂的上層清液吸光度。

Origin 8.0軟件處理不同染料濃度下的溶血率數據得到染料的LD50值。

1.2.3 染料在大腸埃希菌上的毒性效應 用接種環將儲存在瓊脂糖培養基上的大腸埃希菌菌種(儲存溫度為4 ℃)接種在新鮮的液體培養基上，37 ℃過夜培養進行菌株活化，過夜增長的菌株在37 ℃新鮮的培養基上再次進行培養。將相同的大腸埃希菌濃度(1×105個)在不同的試管里培養并讓其增長2 h直到進入對數期生長。現配的不同濃度染料溶液分別加入到處于對數期的大腸埃希菌中，并在相同的條件下進一步培養30 min。然后按不同的濃度倒平板，在37 ℃下培養24 h。完成培養后，計算菌落數。染料抑制率通過沒有加入染料的大腸埃希菌進行估算。

1.2.4 細胞活力的測試 采用噻唑藍(MTT)法測試細胞活力。將NIH/3T3細胞依每孔6×103個細胞接種于96孔板。過夜培養移除培養液，將包含不同濃度(6～100 μmol/L)的染料和培養基的混合液共200 μL添加入96孔板培養48 h。在培養到44 h時，將96孔板里每一個孔用PBS溶液(pH 7.4)沖洗3遍，并加入質量濃度為0.5 g/L的MTT溶液100 μL進行培養。4 h后移除，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL溶解活細胞里的甲瓚結晶。搖床溶解10 min后，在酶標儀490 nm處測試吸收。引起50%細胞死亡的對應的濃度為半數抑制濃度(LD50)。所有的試驗平行做3次。

1.2.5 光譜試驗 紫外吸收光譜和熒光光譜的滴定都是采取逐步滴加的方式。每一次在測試前整個反應系統在室溫下放置5 min，以便于充分反應。

1.2.6 分子模擬 分子模擬的對接模式在AutoDock(在http://autodock.scripps.edu/下載的)上進行。BSA(BSA的ID: 3V03)的三維結構在http://www.rcsb.org/pdb/下載。染料三維結構在Discovery Studio 4.5 Client軟件上完成。BSA在中心盒子上的x-,y-,z-的設置分別為12.6、12.6、12.6 nm。

2 結果與討論

2.1 透皮吸收試驗

皮膚是消費者和美發從業人員第一層也是最重要的保護層。皮膚對大多數染發劑都有潛在的吸收[14]。從3種染料的透皮吸收試驗結果(見圖2)可見，48 h后，藏紅T的透皮濃度達到0.023 mmol/L，并且隨著作用時間延長，透皮吸收濃度逐漸升高。另外，相比之下，藏紅T比堿性品紅和堿性藍26具有更高的透皮吸收濃度，更易透過皮膚，說明藏紅T不是理想的染發劑染料。而在同等的條件下，堿性藍26的經皮吸收率均比藏紅T和堿性品紅低。

這3種染料的不同的經皮吸收效率可以通過它們的分子結構進行解釋。眾所周知，皮膚膜是非極性的，但是它的液體間隙是極性的，因此染料的不同結構在經皮吸收的過程中起了重要的作用[15]。堿性藍26比藏紅T和堿性品紅有更多的苯環結構，結構剛性更強，可能導致堿性藍26更多地積累在皮膚表層而非穿過皮膚。而藏紅T擁有對稱結構使它可能擁有更均衡的油水分配系數，因此穿過皮膚可能就更加容易。

圖2 3種染料的經皮吸收試驗結果

Figure 2 Results of the percutaneous absorption of three hair dyes

2.2 染料的溶血毒性和細菌毒性效應

染料的經皮吸收有可能會導致紅細胞破裂和細胞質溶出[12]。因此，本文進一步測試藏紅T、堿性品紅和堿性藍26對人體紅細胞的溶血情況，結果見表1。可見，堿性藍26比堿性品紅和藏紅T具有更高的溶血率。從染料劑量-溶血率關系(圖3)可見，紅細胞溶血率與染料的濃度呈劑量依賴性。

染料在染發過程中只有很少量進入了發干，大部分是以各種方式排放在環境中，因此可能會導致水資源、土壤肥力、水生生物等污染，這將最終以食物鏈的方式影響到人類的健康。為了評估這些染料對環境的損傷程度，本文用E.coli細菌對染料進行毒性評估研究，結果見表1和圖3。可見，3種不同的染料都在相對較低濃度時對E.coli的活力造成較大的影響，并且隨著染料濃度增高，E.coli活力降低越明顯，堿性品紅和堿性藍26比藏紅T有更低的LD50，表示它們對環境的危害比藏紅T更強[8]。

2.3 染料的細胞毒性

上述試驗證實，藏紅T、堿性藍26和堿性品紅這3種直接性染料能夠透皮吸收，且對紅細胞具有不同程度的溶血率，對人體造成損害。為進一步研究它們對人體的損傷機制，本文選用公認對人體安全無害的姜黃素(CMM)染料作為陽性對照，研究3種染料對胚胎成纖維細胞NIH/3T3系統的毒性效應，結果見圖4。可見，加入藏紅T、堿性藍26和堿性品紅后，NIH/3T3的細胞形態均有明顯的改變，大部分黏附細胞隨著染料作用時間的延長，開始趨于變圓變亮并且開始漂浮于細胞培養液，隨著培養時間的延長，這種現象更加明顯，表明細胞已經逐漸死亡；而加入姜黃素后，NIH/3T3的細胞形態幾乎沒有變化，說明3種直接性染料導致了細胞的死亡。

同時，研究發現，隨著藏紅T、堿性藍26和堿性品紅3種直接性染料與NIH/3T3細胞系統作用的濃度增加，細胞活力呈遞減狀態，劑量與活力的關系見圖5，細胞毒性效應的半數致死量(LD50)見表1。可見，這3種直接性染料對于NIH/3T3細胞系統具有較強的細胞毒性，與皮膚直接接觸可能會對皮膚產生損傷。同時，堿性品紅表現出比藏紅T和堿性藍26更高的細胞毒性效應，表明含有堿性品紅的染發劑可能具有比另外2種染發劑更大的健康威脅。

圖3 不同濃度染料的紅細胞溶血(A)和大腸埃希菌活力(B)測定結果

Figure 3 The hemolytic rate of human RBC (A) and cell viability ofE.Coli(B) under different concentrations of hair dyes

表1 3種染料的紅細胞溶血、大腸埃希菌、NIH/3T3試驗的LD50值和BSA結合參數

注：姜黃素(CMM)作為陰性對照。

圖4 3種染料(濃度為5 μmol/L)在不同時間段對NIH/3T3細胞形態的影響

Figure 4 NIH/3T3 cell morphology after incubated with dyes for different time(5 μmol/L)

圖5 不同濃度染料作用下NIH/3T3細胞活力的改變

Figure 5 NIH/3T3 cell viability under different concentrations of dyes

2.4 染料與BSA的相互作用

“2.1”項透皮試驗結果表明，3種直接性染發劑染料可以不同程度的透過皮膚，進入血液。在血液血清中含有大量的血清白蛋白，而血清白蛋白又是身體里很多內源性和外源性化合物的運輸者。因此，本文嘗試在分子水平上對染料與血清白蛋白作用機制進行研究。

2.4.1 BSA與染料作用的電子吸收光譜變化 蛋白質與小分子物質發生相互作用形成一個新的復合物會造成蛋白質紫外光譜吸收的增加或者減少。從BSA隨著堿性品紅濃度變化的紫外光譜吸收情況(圖6)來看，BSA在280 nm處有吸收峰，這是苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)3種氨基酸的特征吸收峰，滴加染料后BSA的吸收峰發生了明顯的變化[16]。出現這種現象的原因可能是染料與BSA結合后，芳香氨基酸的微環境發生了變化，疏水性增加導致BSA構象變得疏松和伸展，引起280 nm處特征峰的變化[17]。堿性藍26和藏紅T也發生了類似的現象，說明這些染料與蛋白質之間產生了相互作用。

0.80.60.40.20.0吸光度270280290300310λ/nm

注：c(BSA)=10 μmol/L；堿性品紅(FB)的濃度從上至下依次為0、3.2×10-4、6.4×10-4、9.6×10-4、1.28×10-3、1.6×10-3、1.92×10-3、2.24×10-3、2.56×10-3、2.88×10-3、3.2×10-3mol/L；箭頭的指向是堿性品紅滴加入BSA后光譜發生變化的方向。

圖6 不同濃度堿性品紅作用下BSA的紫外吸收光譜

Figure 6 The absorption spectra of BSA under different concen-trations of fuchsin basic

2.4.2 BSA與染料作用的熒光光譜變化 堿性品紅逐步滴加在BSA溶液后，染料與蛋白質結合的熒光變化情況見圖7。可見，BSA的熒光發射光譜隨著滴加堿性品紅的濃度增大發生明顯的淬滅，堿性藍26和藏紅T也發生相似的情況，說明小分子與蛋白質發生結合會引起熒光的淬滅[18]。由于熒光淬滅可能發生動態淬滅和靜態淬滅，常用Stern-Volmer方程(式1)來分析淬滅的機制。

(1)

式中：F和F0分別代表存在和缺乏小分子時的熒光強度，Ksv、Kq、ζ0和[Q]分別表示Stern-Volmer常數、淬滅速率常數、蛋白質壽命常數和淬滅劑的濃度。

從表1可以看出，3種染料的Kq遠大于生物大分子最大的動態淬滅常數2.0×1010[19]，說明它們與BSA發生的是靜態淬滅而非動態淬滅。

式(1)常表示成式(2)來計算染料與BSA的結合常數Kb和獨立結合位點n。

(2)

從3種染料與BSA的結合參數(表 1)可見，它們與BSA的結合位點都大約為1，說明只有1個結合位點。同時，堿性品紅的結合常數要比堿性藍26和藏紅T高。

300350400450λ/nm熒光強度

注：c(BSA)=10 μmol/L；堿性品紅(FB)的濃度從上至下依次為0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、1×10-4、1.2×10-4、1.4×10-4、1.6×10-4、1.8×10-4、2×10-4mol/L；激發波長為280 nm，發射波長為340 nm；箭頭的指向是堿性品紅滴加入BSA后光譜發生變化的方向。

圖7 BSA的熒光發射光譜隨著堿性品紅濃度增大發生的變化

Figure 7 The emission spectra of BSA under different concen-trations of fuchsin basic

2.4.3 BSA與染料作用的分子模擬 將以上熒光光譜和紫外光譜試驗的結果用分子模擬計算進一步驗證，BSA與3種染料結合的模擬計算結果見圖8。

a.堿性品紅； b.藏紅T； c.堿性藍26。

圖8 3種染料與BSA結合最穩固的構象圖

Figure 8 The most stable conformations of BSA binding with three dyes

可見，這些染料均進入了BSA結構內部(口袋區域)，與BSA緊密結合，形成了復合物。這是因為在BSA中，存在著多種疏水和親水性氨基酸，它們可以通過氫鍵與染料緊密結合，如堿性品紅的N1與BSA里His 145的NE2形成一個距離0.288 nm的氫鍵；堿性藍26的N2、N3和N4與BSA里Lys499的NZ、Glu125的OE2、Leu115的O形成氫鍵。另外，BSA又與這些染料之間存在疏水鍵。堿性品紅被Arg144、Tyr 137等氨基酸殘基包圍，最低結合能為-32.06 kJ/mol。堿性藍26被Val481、Leu346、Trp213等氨基酸殘基包圍，最低結合能為-41.44 kJ/mol。藏紅T被Pro415、Tyr496、Lys533等氨基酸殘基包圍，最低結合能為-32.86 kJ/mol。根據以上數據可以得出：3種染料與BSA都具有較穩定的結合構象和較低的結合能，表明BSA與這些染料發生了強烈的相互作用，這與上面光譜試驗的結果一致。

3 結論

直接性染發劑是否對人類存在危害一直是備受爭議的問題。本文采用透皮吸收、紅細胞溶血、大腸埃希菌、NIH/3T3細胞活力試驗替代動物試驗，對3種直接性染料藏紅T、堿性藍26和堿性品紅進行了生物安全性評估。結果表明，堿性品紅與藏紅T對皮膚有潛在的透皮吸收，這3種染料在2015年版《化妝品衛生規范》允許的濃度下對紅細胞溶血、大腸埃希菌和NIH/3T3細胞都表現出了較強的毒性效應。光譜試驗與理論模擬計算結果均表明，這3種染料在進入體內后，與血清蛋白有較強的相互作用。據此認為，這3種直接性染料可能會對人體和環境健康都有潛在的危險，使用時應對其安全性予以重視。

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(責任編輯：陳翔)

The bio-safety concerns and evaluation of three direct hair dyes

JIN Shufang1,2,HU Yong3,SUN Geqin4,WANG Xiahong1,HUANG Yumin1,CHENG Zhenfeng1,

ZHAO Ping1,2,PAN Yufang1,2

Objective To investigate the potential toxicity of three permitted temporary hair dyes,fuchsin basic,basic red 2 and victoria blue B to both the human health and the environment. Methods Skin percutaneous absorption,hemolytic on human red blood cells,cytotoxic effects to NIH/3T3 andE.Colicell lines were detected to evaluate the cytotoxicity. Meanwhile,the interactions of these dyes with albumin from bovine serum were investigated through spectral methods and molecular docking studies. Results Even under permitted concentrations in current Hygienic Standard for Cosmetics,basic red 2 and fuchsin basic had the potential absorption through the skin,with a penetration efficiency to 0.023 mmol/L and 0.010 mmol/L,respectively. Meanwhile,these temporary hair dyes had severe cytotoxicity on human red blood (with LD50from 0.16 mmol/L to 0.23 mmol/L),NIH/3T3 (with LD50from 0.64 μmol/L to 3.77 μmol/L) andE.Colicell lines (with LD50from 2.32 μmol/L to 22.77 μmol/L). Meanwhile,these dyes showed intense interactions with albumin from bovine serum molecules. Conclusion It is suggested that temporary hair dyes could pose risk to both the human health and the environment.

direct hair dyes; hemolytic effect; cytotoxic effects; Albumin from bovine serum

2016-09-07

廣東省自然科學基金項目(2016A03031380);廣東省高等學校優秀青年教師培養項目

金淑芳(1990—),女，2014級碩士研究生；通信作者:趙平(1982— ),女,博士,副教授,從事化妝品安全性評價研究,Email:zhaoping666@163.com。

時間：2016-11-28 15:35

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161128.1535.002.html

TQ658.34

A

1006-8783(2016)06-0717-07

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016090701