猴頭菌絲固體培養物質量標準研究

畢春洋,李國源,陳婷,芮天奇,楊軍輝,李俊松,2

(1.南京中醫藥大學 藥學院,江蘇 南京 210023; 2.江蘇省中藥高效給藥系統工程技術研究中心,江蘇 南京 210023)

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藥物分析

猴頭菌絲固體培養物質量標準研究

畢春洋1,李國源1,陳婷1,芮天奇1,楊軍輝1,李俊松1,2

(1.南京中醫藥大學 藥學院,江蘇 南京 210023; 2.江蘇省中藥高效給藥系統工程技術研究中心,江蘇 南京 210023)

目的 建立猴頭菌絲固體培養物的質量控制方法和標準,為有效控制該藥材的質量提供參考。方法 采用薄層色譜法對猴頭菌絲固體培養物中的甘氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸進行定性鑒別；參照2015年版《中國藥典》中相關方法,分別對猴頭菌絲固體培養物中的水分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分進行測定；分別采用紫外-可見分光光度法和高效液相色譜法測定猴頭菌絲固體培養物中多糖和腺苷的質量分數。結果 薄層色譜定性鑒別斑點清晰,特征明顯；猴頭菌絲固體培養物中水分不得超過11.0%、水溶性浸出率不得低于12.3%、醇溶性浸出率不得低于4.5%、總灰分不得超過6.5%、酸不溶性灰分不得超過1.5%,多糖質量分數不得低于2.23%,腺苷質量分數不得低于0.012 3%。結論 所建立的方法操作簡便、準確度高、重復性好,能全面、有效地控制該猴頭菌絲固體培養物的質量。

猴頭菌絲; 固體培養物； 質量標準； 腺苷； 多糖； 氨基酸

猴頭菌隸屬于擔子菌門、猴頭菌科,因其子實體形如猴頭、色如猴毛,故取名“猴頭”。猴頭菌是著名的藥食兼用菌,性平味甘,具有助消化、利五臟的功能,營養豐富,素有“山珍猴頭,海味燕窩”之說[1]。目前,我國已有100多個以猴頭菌為主要原料的用于胃腸道疾病治療的準字號藥[2]。猴頭菌含有多糖、寡糖、蛋白質、核苷、甾醇、吡喃酮等多種活性成分?，F代藥理研究表明,猴頭菌具有提高免疫力[3]、抗感染[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、降血糖[7]等多種生理功能,長期服用安全有效,極少發現不良反應和毒副作用。本文所用的猴頭菌絲固體培養物為菌絲發酵后培養基與菌絲的復合體,呈棕色或棕黃色的條狀、塊狀、纖維狀。

近年來,有關猴頭菌化學成分、藥理作用的研究報道很多[8-9],但關于其質量標準的研究卻很少,現行部版標準(WS3—B—3457—98)項下僅有鑒別、檢查與多糖含量測定項。為進一步提高猴頭菌絲固體培養物質量控制水平,規范其質量，本文在現行標準的基礎上，對10批猴頭菌絲固體培養物中的甘氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸進行定性鑒別,對水分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、多糖、腺苷含量進行定量測定，為建立猴頭菌絲固體培養物更完善的質控標準提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司),配Waters 2996 PDA檢測器,Empower色譜工作站；TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；CPA225D電子天平(德國Sartorius公司)；Corning LES離心機(美國康寧公司)；TGL-18C-C高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；HH-2K2二孔智能水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司)；KQ-500DE超聲機(昆山市超聲儀器有限公司)；Synergy UV超純水器(上海默克密理博公司)。

1.2 試藥

硅膠G型薄層板(青島海洋化工廠分廠,批號：20150120)；對照品：腺苷(批號：110879-200202)、亮氨酸(批號：110876-200204)、甘氨酸(批號：110735-200102)、組氨酸(批號：890-200001)、蘇氨酸(批號：889-200102)、纈氨酸(批號：140681-201202)、無水葡萄糖(批號：110833-201205),均由中國食品藥品檢定研究院提供；猴頭菌絲固體培養物對照藥材(自制,批號：20151108,腺苷質量分數：0.182 mg/g)；乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純；10批猴頭菌絲固體培養物樣品均由南京老山藥業股份有限公司提供,經江蘇省食品藥品監督檢驗研究院郭青教授鑒定為猴頭菌絲發酵后培養基與菌絲的復合體,批號如下：1(140113),2(140316),3(141026-1),4(141104-2),5(20141108),6(141122-1),7(141122-2),8(141210-2),9(150603),10(150703)。

2 方法與結果

2.1 猴頭菌絲固體培養物TLC鑒別[10]

取本品1 g,加70%(體積分數,下同)乙醇30 mL,加熱回流30 min,濾過,濾液濃縮至約5 mL作為供試品溶液。另取猴頭菌絲固體培養物對照藥材1 g,同法制成對照藥材溶液。再取甘氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸對照品適量,分別加70%乙醇制成每1 mL各含0.5 mg的溶液,作為對照品溶液。參照2015年版《中國藥典》四部“通則0502 薄層色譜法”試驗,吸取供試品溶液與對照藥材溶液各3 μL、對照品溶液各1 μL分別點于同一硅膠G薄層板上,以正丁醇-冰醋酸-水(體積比8∶3∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以質量分數0.2%茚三酮乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點顯色清晰,在日光下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上,分別顯相同顏色的斑點,結果見圖1。

12345ABCDE678910F

A.亮氨酸； B.纈氨酸； C.蘇氨酸； D.甘氨酸； E.組氨酸； F.對照藥材； 1～10. 10批猴頭菌絲固體培養物樣品。

圖1 猴頭菌絲固體培養物TLC圖

Figure 1 TLC chromatogram ofH.erinaceuswith solid cultures

2.2 檢查

2.2.1 水分 取各批樣品粉末(過2號篩)約2 g,精密稱定,參照2015年版《中國藥典》四部“通則0832 水分測定法第二法”進行測定。結果測得10批樣品的水分質量分數在6.48%～10.47%之間,平均為8.89%。根據測定結果,暫定水分不得過11.0%,結果見表1。

2.2.2 水溶性浸出物、醇溶性浸出物 取各批樣品粉末(過4號篩)約2 g,精密稱定,參照2015年版《中國藥典》四部“通則 2201浸出物測定法”進行測定。結果測得10批樣品的水溶性浸出率在13.73%～17.81%之間,平均為15.37%；醇溶性浸出率在4.63%～6.50%之間,平均為5.64%,見表1。根據以上結果,暫定水溶性浸出率不得低于12.3%,醇溶性浸出率不得低于4.5%。

2.2.3 總灰分、酸不溶性灰分 取各批樣品粉末(過4號篩)約3 g,精密稱定,參照2015年版《中國藥典》四部“通則2302 總灰分測定法、酸不溶性灰分測定法”進行測定。結果測得10批樣品的總灰分質量分數在3.86%～6.86%之間,平均為5.16%；樣品酸不溶性灰分質量分數在0.76%～2.02%之間,平均為1.16%,見表1。根據以上結果,暫定總灰分不得超過6.5%,酸不溶性灰分不得超過1.5%。

表1 猴頭菌絲固體培養物水分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分的測定結果

Table 1 The contents of the water,water soluble extract,ethanol soluble extract,total ash,acid insoluble substance inH.erinaceuswith solid cultures(n=2)

w/%

2.3 UV-VIS測定猴頭菌絲固體培養物中多糖的質量分數

2.3.1 對照品溶液的制備 取無水葡萄糖對照品適量,精密稱定,加水制成每1 mL含0.200 5 mg的溶液,即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過4號篩)約0.2 g,精密稱定,置50 mL離心管中,加80%(體積分數,下同)乙醇30 mL,超聲30 min(工作頻率40 kHz,功率250 W),離心15 min(轉速6 000 r/min)后棄去上清液,再加80%乙醇30 mL重復1次。用50 mL水將濾渣移至圓底燒瓶中,加熱回流1 h,趁熱濾過,用30 mL熱水分3次洗滌濾渣及濾紙,濾液收集至100 mL量瓶中,冷卻后加水定容至刻度,搖勻,即得。

2.3.3 線性關系考察 精密量取對照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL,分別置10 mL具塞試管中,各加水至2.0 mL,迅速精密加入硫酸蒽酮溶液5 mL,立即搖勻,水浴中放置10 min后,立即置冰浴中冷卻10 min,取出,以相應的試劑為空白,參照2015年版《中國藥典》“通則0401 紫外-可見分光光度法”在626 nm波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標,質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得多糖回歸方程Y=11.232X+0.018 8(r2=0.999 2),線性范圍為20.1～70.2 μg/mL。

2.3.4 精密度試驗 取葡萄糖對照品溶液稀釋5倍,精密吸取6份,按“2.3.3”項下測定方法分別測定吸光度,結果得RSD值為0.70%,表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復性試驗 取同一批供試品粉末(樣品5)6份,按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.3.3”項下測定方法分別測定吸光度,結果得RSD值為0.95%,表明方法重復性良好。

2.3.6 穩定性試驗 取本品供試品溶液(樣品5),分別于0、10、20、40、60、90、120 min測定吸光度,結果得RSD為0.60%,表明樣品在2 h內穩定。2.3.7 加樣回收率試驗 分別精密量取9份本品供試品溶液(樣品5),每份1 000 μL,分別精密添加葡萄糖對照品溶液160、200、240 μL各3份,加水補至2 mL,混勻,按“2.3.3”項下測定方法分別測定吸光度,計算得平均加樣回收率為100.65%,RSD為1.44%。

2.3.8 樣品中多糖的質量分數的測定 分別測定了10個批次猴頭菌絲固體培養物中多糖的質量分數,每批平行3份。結果測得10批樣品的多糖質量分數在2.05%～3.43%之間,平均為2.79%,結果見表2。根據10批樣品的測定結果,暫定本品含多糖不得低于2.23%。

2.4 HPLC法測定猴頭菌絲固體培養物中腺苷的質量分數

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil100-5 C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：乙腈-水(體積比5∶95)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：260 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。色譜圖見圖3。

0.120.080.040.000.120.080.040.000.120.080.040.00AUAUAU11024681012141618t/minABC

A.對照品； B.供試品； C.陰性對照品； 1.腺苷。

圖2 猴頭菌絲固體培養物HPLC圖

Figure 2 HPLC chromatograms ofH.erinaceuswith solid cultures

2.4.2 對照品溶液的制備 取腺苷對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含20.32 μg的溶液,即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過4號篩)約0.5 g,研細,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入45%(體積分數,下同)甲醇25 mL,密塞,稱定質量,超聲40 min(頻率40 kHz,功率250 W),放冷,再稱定質量,用45%甲醇補足減失的質量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.4.4 線性關系考察 精密量取腺苷對照品溶液,以2倍法稀釋后續對照品溶液,得質量溶度為20.32、10.16、5.08、2.54、1.27 μg/mL系列溶液,分別吸取上述溶液20 μL注入液相色譜儀,測定峰面積。以對照品的濃度為橫坐標,以峰面積值為縱坐標,繪制標準曲線,得腺苷回歸方程為Y=64 281X-941.45(r2=1.000 0),線性范圍為1.27～20.32 μg/mL。

2.4.5 精密度試驗 取對照品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件測定,重復進樣6次,記錄每次所測峰面積。結果得峰面積的RSD值為0.07%,表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復性試驗 取同一批供試品粉末6份(樣品6),按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件測定。結果樣品中腺苷平均質量分數的RSD值為0.95%,表明方法重復性良好。

2.4.7 穩定性試驗 取本品粉末(樣品6),按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液,分別在0、2、4、8、12、18、24 h進樣,按“2.4.1”項下色譜條件測定記錄峰面積。結果得峰面積的RSD為2.59%,表明樣品在24 h內穩定。

2.4.8 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批本品粉末(樣品6)6份,每份約0.25 g,精密稱定,精密加入質量濃度為20.32 μg/mL的對照品溶液2.650 mL,按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件測定記錄峰面積。結果計算得平均回收率為100.8%,RSD為1.27%。

2.4.9 耐用性試驗 比較了3根不同品牌的高純度硅膠鍵合C18柱：① Kromasil 100-5 C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；② Hedera ODS-2柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；③ Welchrom C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。取同一份供試品溶液(樣品6),分別于上述3根色譜柱上進樣,3種不同品牌色譜柱測得的猴頭菌絲固體培養物中腺苷質量分數的RSD值為1.41%(n=3)。

2.4.10 樣品中腺苷質量分數的測定 分別測定了10個批次猴頭菌絲固體培養物中腺苷的質量分數,每批平行3份,結果測得10批樣品的腺苷質量分數在0.007 0%～0.031 7%之間,平均為0.015 4%,結果見表2。根據10批樣品的測定結果,暫定本品含腺苷不得低于0.012 3%。

表2 猴頭菌絲固體培養物中腺苷、多糖質量分數的測定結果

Table 2 The contents of adenosine and polysaccharide inH.erinaceuswith solid cultures (n=3)

No.w(腺苷)/%RSD/%w(多糖)/%RSD/%10.01092.063.070.5220.03170.472.730.1330.01620.992.600.3640.01640.483.430.3150.01821.602.170.6260.01850.353.061.8170.01121.083.240.1880.01510.193.080.1390.00700.192.040.59100.00880.492.521.48

3 討論

本試驗在TLC鑒別中對樣品的提取方法、點樣量、展開劑種類、溶劑比例等條件進行了篩選,最終確定了鑒別方法。從本文結果可見,10批猴頭菌絲固體培養物的TLC圖在與對照品、對照藥材相應的位置上,均出現相同顏色的斑點。多糖是猴頭菌絲固體培養物的主要成分之一,本文對樣品的提取方法、提取時間、料液比、顯色方法、硫酸蒽酮濃度及其加入量和顯色時間等條件進行了考察,最終確定了多糖質量分數的測定方法。

核苷類成分為猴頭菌的主要成分之一,具有鎮靜、擴血管、抗缺氧及較弱的抗感染、降膽固醇等生理活性,且質量分數相對較高[11],因此選擇腺苷作為指標性成分。10批樣品的測定結果表明,腺苷質量分數相對較穩定,這表明腺苷可以作為一個穩定的控制因子,與多糖一起成為復合式的分析指標。

猴頭菌絲固體培養物已在廣泛使用,但其當前的生產標準還不是很完善,因此建立簡單快速考察猴頭菌絲固體培養物的質量方法具有重要意義。根據生產實際,參照“《中國藥典》中藥質量標準研究制定技術要求”有關規定,結合原料藥與猴頭菌絲固體培養物成藥胃樂寧片的實際情況,本次質量標準的上限標準按平均量上浮20%制訂,下限標準按平均量下浮20%制訂。本研究建立的質量標準,方法簡便、準確,重復性好,為全面控制猴頭菌絲固體培養物的質量提供了可靠的方法。

[1] 王曉玉,蔣秋燕,凌沛學,等. 猴頭菌活性成分及藥理作用研究進展[J].中國生化藥物雜志,2010，31(1):70-72.

[2] 尚曉冬,王國艷,潘偉,等. 猴頭菌小分子活性成分研究進展[J].食用菌學報,2012，19(1):79-91.

[3] YIM M J,SHIN J W,SON J Y,et al. Soluble components ofHericiumerinaceuminduce NK cell activation via production of interleukin-12 in mice splenocytes[J]. Acta Pharmacol Sin,2007,28(6):901-907.

[4] WONG Jingyang,ABDULLA M A,RAMAN J,et al. Gastroprotective effects of Lion′s Mane MushroomHericiumerinaceus(Bull.：Fr.)Pers. (Aphyllophoromycetideae)extract against ethanol-induced ulcer in rats[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:492976.

[5] LI Guang,YU Kai,LI Fushuang,et al. Anticancer potential ofHericiumerinaceusextracts against human gastroin-testinal cancers[J]. J Ethnopharmacol,2014,153(2):521-530.

[6] HAN Zihua,YE Jianmin,WANG Guanfu. Evaluation ofinvivoantioxidant activity ofHericiumerinaceuspolysaccharides[J]. Int J Biol Macromol,2013,52:66-71.

[7] LIANG Bin,GUO Zhengdong,XIE Fang,et al. Antihyper-glycemic and antihyperlipidemic activities of aqueous extract ofHericiumerinaceusin experimental diabetic rats[J]. BMC Complement Altern Med,2013,13:253.

[8] 張鵬,圖力古爾,包海鷹. 猴頭菌屬真菌化學成分及藥理活性研究概述[J].菌物研究,2011，9(1):54-62.

[9] JIANG Shengjuan,WANG Songhua,SUN Yujun,et al. Medicinal properties ofHericiumerinaceusand its potential to formulate novel mushroom-based pharmaceuticals[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2014,98(18):7661-7670.

[10] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：2015年版一部[M].北京：中國醫藥科技出版社,2015:1614.

[11] 中國醫學科學院藥物研究所. 中草藥現代研究：第一卷[M].北京：北京醫科大學、中國協和醫科大學聯合出版社,1995:91-103.

(責任編輯：陳翔)

Study on quality standard for Hericium erinaceus with solid cultures

BI Chunyang1,LI Guoyuan1,CHEN Ting1,RUI Tianqi1,YANG Junhui1,LI Junsong1,2

(1.CollegeofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China; 2.JiangsuEngineeringResearchCenterforEfficientDeliverySystemofTCM,Nanjing210023,China)

Objective To establish the quality standard forHericiumerinaceuswith solid cultures in order to control the quality ofH.erinaceusefficiently. Methods Thin-layer chromatography(TLC) was used to identify amino acids(including leucine,valine,threonine,glycine,histidine). According to the methods recorded in the Chinese Pharmacopoeia(2015 Edition),the water,water soluble extract,ethanol soluble extract,total ash,acid insoluble substance inH.erinaceuswith solid cultures were determined. The content of polysaccharide was determined by ultraviolet-visible spectrophotometry(UV-VIS),and the content of adenosine was determined by high performance liquid chromatography(HPLC). Results The TLC identification was highly specific and the spots were clear. The contents of the water,total ash and acid insoluble substance should not exceed 11.0%,6.5% and 1.5%. The water soluble extractive,ethanol soluble extraction,polysaccharide and adenosine should be no less than 12.3%,4.5%,2.23% and 0.012 3%. Conclusion The quality standard established,which can be used for the quality standard ofH.erinaceuswith solid cultures,is simple,accurate,reproducible,and specific.

Hericiumerinaceus; solid cultures; quality standard; adenosine; polysaccharide; amino acids

2016-08-12

畢春洋(1991—),男,2014級碩士研究生,Email：bcy08032328@163.com；通信作者：李俊松(1964—),男,教授,碩士研究生導師,從事中藥炮制與制劑研究,Email：lijunsong1964@163.com

時間：2016-11-25 9:01

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161125.0901.001.html

R284.1

A

1006-8783(2016)06-0724-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016081203