紅樹林內生真菌來源內酯類化合物D1952抗腫瘤活性研究

黃益，于暕辰，唐戈，袁潔，高曉霞

(1.廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 510006； 2.中山大學 中山醫學院，廣東 廣州 510080)

?

紅樹林內生真菌來源內酯類化合物D1952抗腫瘤活性研究

黃益1,2，于暕辰2，唐戈2，袁潔2，高曉霞1

(1.廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 510006； 2.中山大學 中山醫學院，廣東 廣州 510080)

目的 探討紅樹林老鼠簕內生真菌來源內酯類化合物D1952抗腫瘤作用及分子機制。方法 分子對接技術尋找D1952的潛在靶點，四甲基二氮唑藍(MTT)比色法研究D1952抗腫瘤譜；脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)、PI染色法、免疫印跡法(Western blotting)檢測D1952對細胞周期和凋亡的影響及相關信號通路蛋白的變化。結果 細胞周期蛋白激酶2(CDK2)是D1952的潛在靶點；D1952能有效抑制21種腫瘤細胞的增殖，且對MDA-MB-435的半數抑制濃度(IC50)為1.11 μmol/L。TUNEL染色可見腫瘤細胞凋亡明顯；流式細胞術表明其能將MDA-MB-435細胞阻滯于G1/S 期，且D1952能促進PARP的切割、導致p-RB降低和p21的表達增加。結論 紅樹林老鼠簕內生真菌來源化合物D1952具有較好的抗腫瘤活性，并有望成為靶向CDK2的抗腫瘤先導化合物。

紅樹林； 細胞周期蛋白激酶2； 小分子抑制劑； 抗腫瘤

紅樹林因具有陸地到海洋過度獨特的特殊生態系統，蘊藏著極為豐富和多樣的微生物群落，目前以紅樹林來源為代表的天然產物已成為海洋藥物研究的熱點[1-2]，從中發現許多具有新穎結構和較強生物活性的化合物[3]。老鼠簕(AcanthusilicifoliusLinn)為爵床科老鼠簕屬藥用紅樹植物，收錄在《全國中草藥匯編》[4]，主要用于淋巴結腫大、急慢性肝炎、肝脾腫大、胃痛、咳嗽、哮喘等癥。Babu等[5]將鼠簕的乙醇提取物進行鼠類實驗發現其具有抗腫瘤效應。Zhao等[6]從老鼠簕根中發現4個新型2-唑啉酮對腫瘤細胞具有一定的細胞毒性作用。此外，老鼠簕的次生代謝產物及其抗腫瘤活性也有相關報道[7-8]。

細胞周期蛋白激酶(CDK)一直被認為是抗腫瘤藥物及其他增殖失調疾病藥物研發的重要靶點，其抑制劑按作用機制不同，大致可分為ATP競爭性和非競爭性抑制劑[9]，其中ATP競爭性CDK抑制劑在CDK抑制劑研發較多。ATP競爭性CDK抑制劑多為平面雜芳烴結構，由雜環家族組成或衍生而來，也可來源于天然產物[10]。

內酯類化合物D1952來源于紅樹林老鼠簕樹皮內生真菌，具有2個苯環和1個7元環的內酯平面結構，有望成為一個新型CDK抑制劑，本文從分子水平和細胞水平對D1952化合物抗腫瘤作用進行了研究，以期為進一步探索老鼠簕藥用價值，并為該化合物最終成為抗腫瘤藥物先導化合物提供理論依據。

1 材料與試劑

1.1 主要試劑及儀器

胎牛血清(Hyclone)；DMEM完全培養基/1640培養基(Invitrogen)；四甲基偶氮唑藍(Genview)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Promega)；核糖核酸酶RNAase(鼎國生物)；碘化丙啶PI(凱基生物)；Anti-Fade試劑(Life)；人PARP抗體、人p21(Cell Signaling Technology)；α-tubulin、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素、鏈霉素(Sigma)；兔抗、鼠抗、BCA蛋白定量分析試劑盒、ECL顯色液(Pierce)；PVDF膜(Millipore)；CO2細胞培養箱(Thermo)；倒置顯微鏡(Carl Zeiss)；多功能酶標儀(BioTek)。

1.2 細胞系

人白血病細胞系HL-60、K562，人肺癌細胞系A549、NCI-H226、NCI-H460，人結腸癌細胞系COLO205、HCT-116、HCT-15、HT-29、KM12、SW-620、SNB-19、U251，人乳腺癌細胞系MDA-MB-435、MCF7、MDA-MB-231、BT-549、T-47D、MDA-MB-468，人腎癌細胞系SN12C，人前列腺癌細胞系PC-3為中山大學熱帶病防治研究教育部重點實驗室保存，并在已發表的其他研究項目中使用[11-12]。

1.3 化合物D1952與CDK2蛋白晶體結構

海洋小分子化合物來源于國家海洋生物天然產物化合物庫(http://mnpd.sysu.edu.cn/)。該化合物庫收集管理海洋天然產物化合物信息超過13 000條，保藏化合物實物樣品超過2 000個。化合物D1952由中山大學化學與化學工程學院佘志剛教授提供[13]，DMSO溶解為10 mmol/L儲存液。CDK2的晶體結構數據來源于蛋白質數據庫(protein data bank，PDB)。

2 方法

2.1 化合物D1952和CDK2蛋白的結構域對接

采用MOE 8.0軟件對目前進入臨床試驗和臨床前研究的23個CDK小分子抑制劑構建相似度篩選模型，對國家海洋生物天然產物化合物庫的小分子化合物進行篩選。把篩選獲得的候選分子與CDK2(3FZ1)的蛋白晶體結構數據進行分子對接。經過預處理，去水，加氫，處理蛋白，確定活性位點，將D1952與活性位點對接。

2.2 細胞培養

人肺癌細胞系A549、NCI-H226、NCI-H460，人結腸癌細胞系COLO205、HCT-116、HCT-15、HT-29、KM12、SW-620，人膠質瘤細胞SNB-19、U251，人乳腺癌細胞系MDA-MB-435、MCF7、MDA-MB-231、BT-549、T-47D、MDA-MB-468，人腎癌細胞系SN12C，人前列腺癌細胞系PC-3分別培養于含10%(φ)胎牛血清、2 mmol/LL-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、10 mmol/L Hepes(緩沖液)、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養基中。人白血病細胞系HL-60、K562，培養于含10%胎牛血清1640培養基中，置于37 ℃ 5%(φ)CO2孵箱中孵育培養。傳代時用含0.02%EDTA的0.05%胰酶消化，以DMEM完全培養基終止消化。

2.3 MTT比色檢測細胞增殖[14]

2.4 TUNEL染色檢測細胞凋亡

取對數生長期的MDA-MB-435細胞，按照每孔1.0×105個細胞的密度分別接種于已鋪有蓋玻片的24孔細胞培養板中，置于37 ℃ 5%CO2細胞培養箱中培養。細胞孵育24 h后，用不同濃度化合物處理細胞，均以0.1%DMSO為溶劑對照，置于37 ℃ 5%CO2細胞培養箱中培養；處理24 h后，棄去原培養基，加入預冷的4%(φ)甲醛，4 ℃固定細胞30 min，PBS洗滌細胞后，用0.2%Triton X-100室溫下處理5 min，加入100 μL平衡緩沖液覆蓋細胞，室溫下孵育5～10 min后50 μL rTdT 反應緩沖液37 ℃孵育1 h，接著加入2×SSC溶液室溫作用15 min后，PBS洗滌細胞避光干燥蓋玻片過夜。用含DAPI的Anti-Fade試劑于蓋玻片上封片，在熒光顯微鏡下進行觀察并拍照，TUNEL染色陽性熒光信號呈綠色，DAPI熒光信號呈藍色。并取10個視野進行TUNEL染色陽性細胞計數。

2.5 PI染色檢測細胞周期

取對數生長期的細胞2×106接種于60 mm的細胞培養皿中貼壁生長24 h后，分別給予不同濃度D1952作用一定時間后，收集細胞，用PBS洗2次，1 200 r/min離心5 min，棄上清后重懸于75%(φ)乙醇中，過夜，用PBS洗2次后，加入RNAase及PI，37 ℃避光孵育15 min，流式細胞儀檢測(激發波長488 nm，吸收波長為610 nm)，每個樣品20 000個細胞，用ModFit軟件分析。

2.6 Western blotting檢測相關蛋白

收集得到不同濃度梯度處理的細胞裂解液，按BCA法進行蛋白定量，取等量蛋白質加入各電泳通道(約40 μg)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫搖床封閉1 h，TBST(pH=7.6)清洗3次，每次15 min，分別加入PARP(1∶1 000)、人p21(1∶500)、人p-RB(1∶500)以及內參α-tubulin(1∶1 000)并4 ℃過夜后，TBST清洗3次，每次15 min，再孵育相應二抗(1∶1 000)1 h，TBST清洗3次，每次15 min，最后在暗房用ECL顯色液顯色發光。

3 結果

3.1 化合物D1952與CDK2 PDB對接

通過對現有的23個CDKs小分子抑制劑的3D骨架結構及官能團虛擬篩選，發現D1952與flavopiridol相似性最高。因此基于現有flavopiridol的靶點研究和已有的CDK2 的晶體結構[15](PDB code：3FZ1)，通過分子對接，發現D1952與水化Leu83和Glu81的側鏈形成較為牢固的氫鍵；同時與Phe80和Val18形成疊加的π鍵，進而使D1952結合CDK2更加穩定(圖1)。結果表明，化合物D1952與CDK2的非共價鍵的競爭結合方式，但是這種“緊密”的結合模式的精確解析還有待其結構生物學的深入研究。

HOOOHOOOABCD

A. D1952結構圖； B.蛋白與小分子空間位置示意圖； C.小分子蛋白相互作用二維平面圖； D.蛋白小分子相互作用圖。

圖1 D1952與CDK2 活性區域的虛擬對接

Figure 1 D1952 binding with active sites of CDK2 by docking method

3.2 D1952對腫瘤細胞的體外抑制作用

本實驗通過MTT的方法探究D1952對不同組織類型共21種腫瘤細胞增殖的影響，從而進行D1952抗腫瘤研究。如圖2所示，D1952能抑制急性白血病細胞、非小細胞肺癌細胞、人結腸癌細胞、中樞神經腫瘤細胞、人腎癌細胞，人前列腺癌細胞、人乳腺癌細胞的增殖，具有廣泛的抗腫瘤活性。此外，D1952對人乳腺癌細胞MDA-MB-435的生長抑制作用呈現明顯的劑量依賴性，其作用48 h的半數生長抑制濃度為1.11 μmol/L。

3.3 D1952對MDA-MB-435細胞周期的阻滯作用

為了進一步驗證D1952對人乳腺癌細胞周期的阻滯作用，本實驗通過PI單染法檢測不同濃度D1952對MDA-MB-435細胞周期的影響。如圖3所示，D1952可引起MDA-MB-435細胞發生G1/S期阻滯現象，經過1.0 μmol/L、2.0 μmol/L的D1952化合物處理24 h后的G1/S期細胞比例與對照組37.18%，分別上升至39.38%和43.98%。D1952對MDA-MB-435細胞的G1/S期阻滯作用具有一定的濃度依賴性。

3.4 TUNEL染色檢測D1952對人乳腺癌細胞的凋亡誘導作用

為了進一步確定D1952對人乳腺癌細胞的凋亡誘導作用，本研究應用TUNEL染色檢測不同濃度D1952作用24 h后MDA-MB-435細胞的凋亡情況。結果顯示(圖4)， 未經D1952作用的對照組幾乎未

A. 3 μmol/L D1952的抗腫瘤譜； B. 不同濃度的D1952對人乳腺癌細胞MDA-MB-435作用48 h的抑制效果。

A. D1952誘導MDA-MB-435細胞周期變化分析； B. D1952作用于MDA-MB-435細胞的細胞周期時相分布。

A. D1952誘導MDA-MB-435細胞凋亡的結果； B. D1952作用于MDA-MB-435細胞的TUNEL陽性細胞定量。

圖4 TUNEL染色檢測D1952對MDA-MB-435細胞的凋亡誘導作用

Figure 4 Effect of D1952 on the apoptosis of MDA-MB-435 cells

見TUNEL染色陽性細胞；經D1952作用后，TUNEL染色陽性細胞明顯增加。熒光顯微鏡下隨機選取10個視野計數陽性細胞比例，可見隨著D1952濃度的升高，TUNEL染色陽性細胞比例逐步增高，呈劑量依賴性。濃度為1.0 μmol/L的D1952作用24 h后，MDA-MB-435細胞TUNEL染色陽性率均達到20.05%；2.0 μmol/L濃度的D1952作用24 h后，MDA-MB-435細胞TUNEL染色陽性率均達到26.49%。

3.5 D1952作用后MDA-MB-435細胞中凋亡蛋白及細胞周期蛋白表達變化

為明確D1952導致人乳腺癌細胞MDA-MB-435凋亡的分子機制，本文以2個不同濃度的D1952作用于MDA-MB-435細胞24 h后，檢測到相關的蛋白表達。如圖5所示，隨著該化合物濃度的提高，凋亡相關蛋白PARP前體降低，而剪切體升高，這指示該化合物能夠促使細胞凋亡；細胞周期抑制蛋白p21表達水平比對照組有所升高，而p-RB表達水平降低，這提示該化合物可能通過阻滯細胞G1周期來促進細胞的凋亡。

123MDA-MB-435(24h)IntactPARPCleavedPARPp21p-RBα-tubulin

1. Control； 2. 1.0 μmol/L D1952； 3. 2.0 μmol/L D1952。

圖5 D1952作用后MDA-MB-435細胞中的PARP、p21和p-RB的表達水平

Figure 5 Effect of D1952 on the expression of PARP,p21and p-RB in MDA-MB-435 cells

4 討論

近年研究發現，癌細胞中大多存在細胞分裂周期基因的活化、過度表達及CDKIs(CDK inhibitor，CDKIs)功能的缺損[16]，與其相對的CDKIs發揮抑制細胞周期的制動器作用。本文利用計算機輔助尋靶點的方法，首先篩選出于D1952具有相似3D空間結構的CDK小分子抑制劑Flavopiridol，在臨床前研究中Flavopiridol表現出誘導細胞凋亡和腫瘤生長抑制活性，此外Flavopiridol對CDK1、2、4的抑制活性試驗，以及與酶ATP 結合口袋的三維晶體結構確證了Flavopiridol與CDKs的相互作用[17]。因此，本文通過對Flavopiridol已有研究報道的靶點進行分析，將D1952與現有的蛋白晶體結構CDK2進行分子對接，預測其靶點。已有研究表明，Flavopiridol與CDK2的晶體結構顯示其5-羥基和4-酮能分別與CDK2主干上Glu81的羰基氧和Leu83的氨基NH形成兩條氫鍵作用[18]，本實驗對接結果發現D1952也能水化Leu83和Glu81的側鏈形成較為牢固的氫鍵，同時，D1952還能與Phe80淺腔中Phe80共軛結合。近年來研究者發現該淺腔只能容納體積較小的疏水性基團，對該淺腔不同程度占據表明小分子抑制劑的活性具有選擇性[19]。同時本研究對D1952體外抗腫瘤活性及其機制進行了研究，通過實驗發現D1952能有效抑制不同組織類型共21種腫瘤細胞增殖，具有廣泛的抗腫瘤活性。TUNEL實驗進一步表明D1952具有誘導MDA-MB-435細胞凋亡的作用。此外，通過細胞周期實驗驗證發現，D1952能誘導腫瘤細胞造成G1/S期阻滯，引起細胞凋亡。

在哺乳動物細胞中，CDK單體沒有活性，只有與相應的調節亞基cyclin結合后才能變成有活性的穩定構象。CDK/cyclin的活化也受到內源性抑制子抑制、活化及抑制磷酸化的調節。其中p21 Waf1/Cip1蛋白作為一種細胞周期抑制蛋白，可以與CDK2形成復合體，限制其構象改變，抑制酶活，同時當CDK2與cyclin E結合受到抑制時，導致視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，RB)磷酸化減少，從而促進RB與轉錄因子E2F結合并抑制其活性，造成G1/S阻滯[20]。為探討D1952抗腫瘤的分子機制，采用Western blotting分析了細胞周期及凋亡相關蛋白變化，結果表明，D1952作用后，MDA-MB-435細胞中的凋亡效應蛋白PARP發生裂解，及細胞周期抑制蛋白p21表達量升高，同時p-RB減少，一定程度上說明D1952能夠靶向CDK2誘導細胞通過p21和p-RB抑制細胞周期活動從而引起細胞凋亡而發揮抗腫瘤的活性。該結果為深入研究D1952抗腫瘤活性的分子機制提供了線索，并為進一步開發抗腫瘤新型候選藥物奠定了基礎。

[1] 洪葵.紅樹林放線菌及其天然產物研究進展[J].微生物學報,2013,53 (11):1131-1141.

[2] 康偉.海洋生物活性物質發展研究[J].亞太傳統醫藥,2014,10(3):47-48.

[3] WU Jun,XIAO Qiang,XU Jing,et al. Natural products from true mangrove flora: source,chemistry and bioactivities[J]. Nat Prod Rep,2008,25(3):955-981.

[4] 《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編[M].北京：人民衛生出版社，1978:231-232.

[5] BABU B H,SHYLESH B S,PADIKKALA J. Tumor reducing and anticarcinogenic activity of Acanthus ilicifolius in mice[J]. J Ethnopharmacol,2002,79(1):27-33.

[6] ZHAO Dan,XIE Lijun,YU Lei,et al. ChemInform abstract: new 2-Benzoxazolinone derivatives with cytotoxic activities from the roots ofAcanthusilicifolius[J]. J Cheminform，2015,63(12):1087-1090.

[7] ISLAM M A,SAIFUZZAMAN M,AHMED F,et al. Anti-nociceptive activity of methanolic extract ofAcanthusilicifoliusLinn. Leaves[J]. TUrk J Pharm Sci,2012,9(1):51-60.

[8] 孫世偉，林貞健，朱天驕，等.老鼠簕植物內生真菌Aspergillusterreus(W-8)抗腫瘤活性成分的研究[J].中國海洋大學學報(自然科學版)，2011，41(S1):349-355.

[9] PEYRESSATRE M,PRéVEL C,PELLERANO M,et al. Targeting cyclin-dependent kinases in human cancers: from small molecules to Peptide inhibitors[J]. Cancers,2015,7(1):179-237.

[10] ASGHAR U,WITKIEWICZ A K,TURNER N C,et al. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy[J]. Nat Rev Drug Discov,2015,14(2): 130-146.

[11] JIANG Lili,MAO Pu,SONG Libing,et al. miR-182 as a prognostic marker for glioma progression and patient survival[J]. Am J Pathol,2010,177(1):29-38.

[12] LIU Liping,CHEN Kun,WU Jueheng,et al. Downregulation of miR-452 promotes stem-like traits and tumorigenicity of gliomas[J]. Clin Cancer Res,2013,19(13):3429-3438.

[13] PAN Jiahui,DENG Juanjuan,CHEN Yiguan,et al. New lactone and xanthone derivatives produced by a mangrove endophytic fungus phoma sp. SK3RW1M from the south china sea[J]. Helv Chim Acta,2010,93(7):1369-1374.

[14] XIE Gue’e,ZHU Xun，LI Qing,et al. SZ-685C,a marine anthraquinone,is a potent inducer of apoptosis with anticancer activity by suppression of the Akt/FOXO pathway[J]. Br J Pharmacol,2010,159(3):689-697.

[15] DENG Yongqi,SHIPPS G W,ZHAO Lianyun,et al. Modulating the interaction between CDK2 and cyclin with a quinoline-based inhibitor[J]. ACS Med Chem Lett,2014,24(1):199-203.

[16] CICENAS J,KALYAN K,SOROKINAS A,et al. Highlights of the latest advances in research on CDK inhibitors[J]. Cancers,2014,6(4):2224-2242.

[17] SHAPIRO G I. Preclinical and clinical development of the cyclin-dependent kinase inhibitor flavopiridol[J]. Clin Cancer Res,2004,10(10):4270-4275.

[18] 白曉光,許樂幸,李祎亮，等.基于靶蛋白結構的CDK2小分子抑制劑研究進展[J].中國新藥雜志,2011,20(17):1667-1672.

[19] BUGELSKI P J,KIM C. T-dependent antigen response (TDAR) tests: meta-analysis of results generated across multiple laboratories[J]. J Immunotoxicol,2007,4(2):159-164.

[20] CANAVESE M,SANTO L,RAJE N. Cyclin dependent kinases in cancer[J].Cancer Biol Ther,2014,13(7): 451-457.

(責任編輯：幸建華)

Potent antineoplastic effects of a lactone D1952 derived from mangrove microbes

HUANG Yi1,2,YU Jianchen2,TANG Ge2,YUAN Jie2,GAO Xiaoxia1

(1.SchoolofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.ZhongshanSchoolofMedicine,Sun-YatSenUniversity,Guangzhou510080,China)

Objective To investigate the antineoplastic activity and mechanism of D1952,a lactone derived from mangrove microbes,at both cellular and molecular levels. Methods The target of D1952 was predicted by molecular docking. MTT assay was utilized to study cytotoxicity of D1952 on different tumor cells. Effects of D1952 on cell cycle and apoptosis were tested by terminal deoxynucleotidyl transferase (TDT)-mediated biotinylated deoxyuridine triphosphate (dUTP)-biotin nick end labeling (TUNEL) staining,PI staining and western blotting. Results D1952 effectively inhibited the proliferation of 21 tumor cells with potentially targeting CDK2. The half maximal inhibitory concentration (IC50) of D1952 in MDA-MB-435 cells was 1.11 μmol/L. D1952 induced cell apoptosis and apoptosis protein PARP was cleaved leading increased P21 and decreased p-RB. D1952 also induced cell cycle arrest at the G1/S phase. Conclusion D1952 derived from mangrove microbes displays the antitumor activity,which is expected to be a lead compound targeting CDK2 in relevant tumors.

mangrove; CDK2; small molecule inhibitor; antitumor

2016-08-12

海洋公益性行業科研專項(201305017); 海洋經濟創新發展區域示范專項(GD2012-D01-001)

黃益(1991—)，女，2014級碩士研究生，Email: huanghuayu57@yahoo.com；通信作者: 高曉霞 (1972—)，女，博士，教授，主要從事中藥制劑質量控制研究，Email: gaoxxia91@163.com；袁潔(1978—)，女，博士，副教授，主要從事海洋活性分子的藥物靶點及分子機制研究，Email: yuanjie@mail.sysu.edu.cn。

時間：2016-11-29 9:37 ttp://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161129.0937.001.html

R965

A

1006-8783(2016)06-0737-06

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016081202