還原敏感性中間體R-ss-COOH的合成

陳思，何建興，朱全紅，胡巧紅,3

(1.廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 510006； 2.南方醫(yī)科大學 中醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510515； 3.廣東藥科大學 藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州 510006)

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藥物化學

還原敏感性中間體R-ss-COOH的合成

陳思1，何建興1，朱全紅2，胡巧紅1,3

(1.廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 510006； 2.南方醫(yī)科大學 中醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510515； 3.廣東藥科大學 藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州 510006)

目的 合成一系列含二硫鍵的中間體，以用于后期制備具有還原敏感性、兩親性的納米載體材料。方法 以3,3′-二硫代二丙酸(DTDP)、脂肪醇為原料，碳二亞胺類為失水劑，在4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化下，DTDP一端的—COOH與脂肪醇的—OH發(fā)生酯化反應合成3,3′-二硫代二丙酸脂肪醇單酯(R-ss-COOH)，產(chǎn)物經(jīng)柱色譜分離純化，并用FT-IR和1H-NMR、MS進行結(jié)構(gòu)確證。結(jié)果 與DCC/DMAP催化體系相比，EDCI/DMAP催化體系所得反應液澄清，副產(chǎn)物易于除盡。經(jīng)FT-IR、1H-NMR、MS確證，成功合成了不同碳鏈的還原敏感性中間體C14-ss-COOH、C16-ss-COOH和C18-ss-COOH。結(jié)論 應用EDCI/DMAP催化體系合成R-ss-COOH的方法易于操作，相對簡單。合成的系列R-ss-COOH可作為中間體，用于制備還原敏感型兩親性聚合物納米材料。

還原敏感性； 3,3′-二硫代二丙酸脂肪醇單酯； 二硫鍵； 碳二亞胺類

細胞內(nèi)存在著一種豐富的生物還原劑谷胱甘肽(GSH)。正常細胞內(nèi)GSH的濃度大約是2～10 mmol/L,尤其是在細胞質(zhì)和線粒體、細胞核等細胞器中；血液及細胞外基質(zhì)中GSH的濃度為2～20 μmol/L，而腫瘤細胞內(nèi)GSH的濃度至少是正常細胞的4倍[1-2]。含二硫鍵的物質(zhì)在細胞外低GSH濃度條件下較穩(wěn)定，一旦進入腫瘤細胞內(nèi)，由于較高濃度的GSH，則表現(xiàn)出很強的還原敏感性，二硫鍵能夠迅速裂解。

基于這一原理，以還原敏感聚合物納米載體(reduction-sensitive polymeric nanocarriers,RSPNs)實現(xiàn)抗腫瘤藥物的細胞內(nèi)靶向遞送，是目前智能響應型納米載體的研究熱點之一[3-4]。近幾年研究表明，利用還原敏感的智能響應型納米載體包載抗癌藥物，能夠?qū)崿F(xiàn)在體循環(huán)中有較好的穩(wěn)定性，到達靶部位前藥物不釋放，而進入靶部位后藥物可快速、完全釋放發(fā)揮作用。如，文獻[5]合成了以脫氧膽酸(DOCA)為疏水鏈，基于透明質(zhì)酸(HA)主動靶向及還原敏感智能響應型的HA-ss-DOCA共聚物，自組裝形成膠束后，實現(xiàn)了紫杉醇的乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)遞送。文獻[6]合成了以胱胺為二硫鍵響應的HA-ss-PLGA載體，用于CD44受體介導的腫瘤靶向治療，實現(xiàn)多重靶向。文獻[7]合成了基于殼聚糖糖脂的納米載體CSO-ss-SA，CSO為親水鏈段，十八胺(SA)為疏水鏈段形成兩親性自聚集納米粒，結(jié)果表明能選擇性地對腫瘤細胞內(nèi)還原環(huán)境做出響應。文獻[8]合成了一種還原敏感型兩親性聚合物HA-ss-PLGA，該聚合物形成的納米粒能有效地將阿霉素和環(huán)巴胺共同遞送到乳腺癌細胞和腫瘤干細胞內(nèi)，載藥納米粒中藥物的釋放表現(xiàn)出較好的還原敏感性。

3,3′-二硫代二丙酸(DTDP)，不僅結(jié)構(gòu)中有二硫鍵，在還原性條件下能夠迅速斷裂；同時由于兩端各有1個羧基，易與羥基或氨基發(fā)生反應形成共價結(jié)合，適于作為連接臂用于后期修飾。研究表明，烷基鏈作為膠束的疏水核心，能夠通過融合和疏水作用誘導生物膜的微擾效應，其較好的親和性能促進載體進入細胞甚至細胞器中[9]。

本文選擇不同碳鏈長度的脂肪醇R-OH與DTDP反應，制備含二硫鍵的3,3′-二硫代二丙酸脂肪醇單酯(R-ss-COOH)，以用作后期合成還原敏感性的兩親性聚合物納米材料的重要中間體。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FA2004B電子天平(上海精科天美科學儀器有限公司)；78HW-1恒溫磁力攪拌器(金壇市富華儀器有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海市亞榮生化有限公司)；傅立葉變換紅外光譜儀(Spectrum100 PerkinElmer)；X-6顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司)；AV-400全數(shù)字化超導核磁共振譜儀(德國Bruker公司)； 液相質(zhì)譜聯(lián)用儀ORBITRAP(LTQ Orbitrapxl,Thermo Scientific公司)。

3,3′-二硫代二丙酸(DTDP)、十六醇(C16-OH)、十四醇(C14-OH)、十八醇(C18-OH)、N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)均購自上海麥克林生化科技有限公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI，上海共價化學試劑有限公司)；N,N′-二甲基甲酰胺(DMF，天津市大茂化學試劑廠)；乙酸乙酯(天津彩云飛化工銷售有限公司)；石油醚(沸程: 60～90 ℃，天津彩云飛化工銷售有限公司)；甲醇(色譜級，天津市科密歐化學試劑有限公司)；薄層層析硅膠GF254(化學純，青島海洋化工有限公司)；柱層析硅膠(試劑級，100～200 目，青島海洋化工有限公司)；單質(zhì)碘(天津市大茂化學試劑廠)；去離子水；其他試劑均為市售分析級。

1.2 R-ss-COOH的合成

1.2.1 C16-ss-COOH的合成 參考文獻[10]方法并經(jīng)改進，以EDCI為失水劑、DMAP為催化劑，使DTDP一端的羧基和C16-OH的羥基發(fā)生酯化反應合成C16-ss-COOH，具體步步驟如下：將1.1 mmol DTDP溶于適量無水DMF中，加入1.2 mmol EDCI和0.2 mmol DMAP，在N2條件下，磁力攪拌溶解后加入1 mmol C16-OH，室溫反應24 h。

另一種方法是以DCC為失水劑、DMAP為催化劑，具體步驟如下：稱取1.1 mmol DTDP、1.1 mmol DCC，置于三頸瓶中，加入10 mL無水DMF，在N2條件下，磁力攪拌使完全溶解，再加入1.1 mmol DMAP 和1 mmol C16-OH，冰浴反應1 h后，室溫反應24 h。

通過比較以上EDCI、DCC為失水劑的反應情況和粗產(chǎn)物分離純化情況，篩選出合適的催化體系。合成路線見圖1。

圖1 C16-ss-COOH的合成路線

Figure 1 Synthetic route of C16-ss-COOH

1.2.2 其他R-ss-COOH的合成 根據(jù)上述篩選確定的反應條件，分別用C14-OH、C18-OH與DTDP反應制備含不同碳鏈的3,3′-二硫代二丙酸脂肪醇單酯C14-ss-COOH和C18-ss-COOH。

1.3 結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 FT-IR測定 取干燥的KBr 100 mg與適量的樣品混合壓片后，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描。

1.3.2 熔點測定 用顯微熔點儀對一系列R-ss-COOH進行熔點測定。

1.3.31H-NMR測定 根據(jù)樣品的溶解情況，選用CDCl3或DMSO-d6為溶劑，采用AV-400全數(shù)字化超導核磁共振譜儀進行測定。

1.3.4 MS測定 分別將一定量的產(chǎn)物溶于甲醇，采用液相質(zhì)譜聯(lián)用儀ORBITRAP在負離子模式下進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 R-ss-COOH的合成

由于 DTDP兩端各有1個活性的羧基基團，與脂肪醇R-OH反應時可能發(fā)生兩端羧基的酯化。為了盡可能使一端羧基發(fā)生酯化，需控制DTDP與脂肪醇的投料比，故本文按DTDP與R-OH的摩爾比為1.1∶1投料進行反應。

2.1.1 C16-ss-COOH的合成 DMF沸點為158 ℃，一般較難除去。考慮到產(chǎn)物不溶于水，同時DTDP溶于水，故采用萃取的方法，先向反應液中加入大量的水，再用乙酸乙酯萃取。通過改變?nèi)軇┫到y(tǒng)極性，使不溶于水的產(chǎn)物游離出來；同時用水能洗去一定量未完全反應的酸，對粗產(chǎn)物后處理有一定的幫助。萃取后，水層經(jīng)TLC點樣監(jiān)測至無產(chǎn)物斑點，表明萃取較完全。萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得粗產(chǎn)物后，經(jīng)硅膠柱色譜進行分離純化。

先以石油醚-乙酸乙酯(6∶1，體積比)為洗脫劑除去二酯、脂肪醇，然后以石油醚-乙酸乙酯(5∶1，體積比)洗脫目標產(chǎn)物，38 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得白色固體粉末。以DCC為失水劑反應、分離純化后的收率為21.07%，EDCI為失水劑反應、分離純化后的收率為26.00%。

在比較篩選不同失水劑的試驗中，以DCC為失水劑反應后得黃色渾濁溶液，有白色沉淀N,N′-二環(huán)己基脲(DCU)生成，粗產(chǎn)物經(jīng)柱色譜分離純化后，產(chǎn)物經(jīng)FT-IR(圖略)表征，圖譜指紋區(qū)出現(xiàn)許多雜峰；而以EDCI為失水劑反應得黃色澄清溶液，粗產(chǎn)物純化后FT IR顯示，特征峰明顯。

DCC/DMAP體系是經(jīng)典的方法，以DCC作失水劑，反應產(chǎn)率高，在碳二亞胺類反應中應用較多。由于DCC參與的反應，生成的副產(chǎn)物DCU不溶于水，雖然過濾能除去一定的副產(chǎn)物，但仍有少量殘留，純化過程較為繁瑣；而EDCI參與反應生成的副產(chǎn)物呈水溶性，后處理操作相對簡單。因此，確定以EDCI/DMAP為反應催化體系。

2.1.2 C14-ss-COOH、C18-ss-COOH的合成 采用EDCI/DMAP催化體系，在“2.1.1”項確定的反應條件下，將DTDP分別與十四醇、十八醇反應，合成含二硫鍵的不同碳鏈長度的中間體C14-ss-COOH和C18-ss-COOH。反應液均為淺黃色透明溶液，其中C14-ss-COOH 的收率為21.39%，C18-ss-COOH的收率為17.09%。

2.2 R-ss-COOH的表征

4000300020001000ABCDEν/cm-1

圖2 DTDP(A)、C16-OH(B)、C14-ss-COOH(C)、C16-ss-COOH(D)、C18-ss-COOH (E)的FT-IR圖譜

Figure 2 FT-IR spectrum of DTDP(A)，C16-OH (B)，C14-ss-COOH(C)，C16-ss-COOH (D) and C18-ss-COOH(E)

2.2.2 熔點 3種目標產(chǎn)物熔點測定結(jié)果分別是：C14-ss-COOH為70.5～71.6 ℃；C16-ss-COOH為72.3～73.8 ℃；C18-ss-COOH為76.5～77.4 ℃。

2.2.31H-NMR圖譜 C14-ss-COOH、C16-ss-COOH、C18-ss-COOH的1H-NMR見圖3。

C14-ss-COOH(400 MHz,CDCl3)δ：4.10(t,2H,J=6.8 Hz,5-H)，2.97～2.88(m,4H,2-H,3-H)，2.84～2.78(m,2H,4-H)，2.74(t,2H,J=7.2 Hz,1-H)，1.70～1.55(m,2H,6-H)，1.39～1.29(m,2H,17-H)，1.32～1.20(m,20H,7-H,8-H,9-H,10-H,11-H,12-H,13-H,14-H,15-H,16-H)，0.88 (t,3H,J=7.0 Hz,18-H)。

C16-ss-COOH(400 MHz,CDCl3)δ：4.12(t,2H,J=6.8 Hz,5-H)，3.04～2.90(m,4H,2-H,3-H)，2.85～2.79(m,2H,4-H)，2.75(t,2H,J=7.1 Hz,1-H)，1.75～1.57(m,2H,6-H)，1.33～1.20(m,2H,19-H)，1.49～1.24(m,24H,7-H,8-H,9-H,10-H,11-H,12-H,13-H,14-H,15-H,16-H,17-H,18-H)，0.90 (t,3H,J=6.8 Hz,20-H)。

C18-ss-COOH(400 MHz,CDCl3)δ：4.12(t,2H,J=6.8 Hz,5-H)，3.05～2.86(m,4H,2-H,3-H)，2.86～2.78(m,2H,4-H)，2.76(t,2H,J=7.2 Hz,1-H)，1.61(dt,2H,J=55.6,27.9 Hz,6-H)，1.30(d,30H,J=17.9 Hz,7-H,8-H,9-H,10-H,11-H,12-H,13-H,14-H,15-H,16-H,17-H,18-H,19-H,20-H,21-H)，0.90(t,3H,J=6.8 Hz,22-H)。

以上C16-ss-COOH的1H-NMR圖譜與文獻[10]報道的一致，可見合成的產(chǎn)物為單酯C16-ss-COOH。C14-ss-COOH、C18-ss-COOH的1H-NMR圖譜如圖3所示，各位置H的化學位移均能夠?qū)?/p>

dfgecbabbabcndOOHOOSSfgfe5.04.54.03.53.02.52.01.51.00.5δABC

圖3 C14-ss-COOH(A)、C16-ss-COOH(B)、C18-ss-COOH(C)的1H NMR圖譜

Figure 31H NMR spectrum of C14-ss-COOH,C16-ss-COOH and C18-ss-COOH

2.2.4 MS圖譜 3種目標產(chǎn)物的質(zhì)譜圖見圖4。可見，質(zhì)荷比為811、867、923的峰屬于[2M+1]+，相對分子質(zhì)量分別為405、433、462，分別對應C14-ss-COOH、C16-ss-COOH和 C18-ss-COOH，表明已成功合成目標產(chǎn)物R-ss-COOH。

3 結(jié)論

利用二硫鍵的還原敏感性，將對GSH敏感的DTDP一端羧基與疏水性的脂肪醇反應生成R-ss-COOH。通過對2種失水劑DCC、EDCI與DMAP的體系反應后的現(xiàn)象、后處理步驟、收率的比較，篩選出EDCI/DMAP為適合的反應體系。用水將產(chǎn)物游離后，再用乙酸乙酯萃取反應液，粗產(chǎn)物過柱分離純化后得到目標產(chǎn)物C16-ss-COOH。用篩選的催化體系合成了不同碳鏈的中間體R-ss-COOH，該結(jié)構(gòu)含有二硫鍵及疏水鏈，可作為中間體與親水性的聚合物反應，合成具有自組裝能力的還原敏感性兩親性聚合物，有望作為具有還原敏感性的納米載體。

100806040200相對豐度100806040200100806040200ABC200018001600140012001000200400600800m/z相對豐度相對豐度

圖4 C14-ss-COOH(A)、C16-ss-COOH(B)、C18-ss-COOH(C)的 ESI質(zhì)譜圖(負離子模式)

Figure 4 ESI of C14-ss-COOH(A),C16-ss-COOH(B) and C18-ss-COOH(C)

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(責任編輯：陳翔)

Synthesis of reduction-sensitive intermediates R-ss-COOH

CHEN Si1,HE Jianxing1,ZHU Quanhong2,HU Qiaohong1,3

(1.DepartmentofPharmaceutics,SchoolofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofTraditionalChineseMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China; 3.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofNewDosageForm,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective To synthesize a series of reduction-sensitive intermediates,which were further used to prepare reduction-sensitive amphiphilic polymers. Methods Using carbodiimide as coupling reagent and DMAP as catalyst,3,3′-dithiodipropionic acid (DTDP) was conjugated with fatty alcohols via ester bonding between one carboxyl group of DTDP and the hydroxy group of fatty alcohols to prepare 3,3′-thiodipropionate fatty alcohol monoester (R-ss-COOH). The crude products were purified by column chromatography. The structures were confirmed by the Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR),proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR) and mass spectrometer (MS). Results Compared with DCC/DMAP,EDCI/DMAP produced transparent reaction solution and its by-products were easier to be removed. FT-IR,1H-NMR and MS confirmed that a series of reduction-responsive intermediates with different carbon length,C14-ss-COOH,C16-ss-COOH and C18-ss-COOH,were synthesized successfully. Conclusion The esterification process with EDCI/DMAP is simple and feasible. R-ss-COOH may be excellent intermediates to synthesize reduction-responsive amphiphilic polymers as nanocarrier materials.

reduction-sensitive; 3,3′-thiodipropionate fatty alcohol monoester; disulfide bond; carbodiimide

2016-08-06

國家自然科學基金資助項目(81673594)

陳思(1992—)，女，2014級碩士研究生，Email:chensi622@hotmail.com；通信作者：胡巧紅(1969—)，女，博士，教授，碩士研究生導師，主要從事藥物新劑型與新技術研究，Email:hu_qiaohong@163.com。

時間：2016-11-24 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161124.1613.004.html

R914.5

A

1006-8783(2016)06-0700-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016080601