青霉啤酒糟培養基配方優化研究

賓冬梅，戴麗丹，2，李玉中

（1.衡陽師范學院生命科學與環境學院，湖南衡陽421008；2.婁底市第一中學城南校區，湖南婁底417000）

青霉啤酒糟培養基配方優化研究

賓冬梅1，戴麗丹1，2，李玉中1

（1.衡陽師范學院生命科學與環境學院，湖南衡陽421008；2.婁底市第一中學城南校區，湖南婁底417000）

為了更好地利用啤酒糟，從富含纖維素的土壤中分離和篩選纖維素高效降解的青霉，在純啤酒糟中加入不同比例的N源、C源配制不同的培養基，接種等量活化后的青霉孢子懸浮液，觀察菌絲生長情況以及測定菌株的酶活力和產生的孢子數，篩選促進菌株生長的最優配方。結果表明，最優N源是胰蛋白胨，最適比例為25∶1；最優C源是乳糖，最適比例為25∶1；這2種化合物混合，N源、C源分別為25∶1，30∶1時，菌絲生長最旺盛，產孢子數最多，為7.80×109個/mL；N源、C源分別為30∶1，25∶1時，羧甲基纖維素鈉（CMCNa）酶活力最高，達476 U/mL。表明啤酒糟可以作為青霉的優良培養基，對選育優良的啤酒糟纖維素分解菌具有一定的指導意義。

青霉1-4；啤酒糟；N源；C源；纖維素酶

啤酒糟是生產啤酒的主要原料大米、麥芽等經糊化、糖化工藝進行過濾或壓濾之后殘留的固體物質，主要成分包括蛋白質、纖維組分、維生素、脂肪、礦物質及淀粉[1]等，且含水量大，容易變質。啤酒企業直接將啤酒糟作為粗飼料銷售，因纖維含量高、適口性差，養殖戶不能完全接收[2-5]，不少企業將其作為廢棄物排放，不僅造成資源浪費，甚至產生嚴重的環境污染。針對啤酒糟粗纖維及粗蛋白高的營養特點，優選出纖維素酶高產菌，將纖維素分解成可供利用的糖類，再經酵母菌和枯草芽孢桿菌進行二次混菌發酵，生產出高微生物蛋白啤酒糟飼料或微生態制劑，達到立體開發啤酒糟的目的。

目前，國內外產纖維素酶的主要菌種有曲酶、木霉等[6-11]，暫時無利用青霉菌種的報道。本試驗從富含纖維素的土壤中分離和篩選纖維素高效降解青霉，以啤酒糟為主料，以加入不同C源、N源的比例來觀察青霉生長數目與形態，從而得出青霉產纖維素酶活性最高的培養配方，為啤酒糟開發利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料試驗所用啤酒糟取自衡陽燕京啤酒廠，經過干燥，過0.149 mm篩，儲存備用；從富含纖維的土壤中提取活性菌種，在實驗室鑒定為青霉。

1.1.2 富集培養基濾紙條液體培養基：NaCl 0.1 g，（NH4）2SO43.0 g，FeSO4·7H2O 0.005 g，KH2PO41.0 g，MnSO4·H2O 0.001 6 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，ZnSO4· 7H2O 0.001 7 g，CaCl20.1 g，CoCl20.002 g，蒸餾水1 000 mL（將5 mL混合液加入試管，之后再放入1 cm×6 cm的濾紙條滅菌即是濾紙條液體培養基），pH值6.5。活化培養基（PDA培養基）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。參照方中達[12]方法配制。剛果紅纖維素瓊脂培養基[13]：KH2PO40.5 g，MgSO40.25 g，瓊脂14 g，明膠2 g，纖維素粉1.88 g（纖維素粉預先經1 mmol/L鹽酸冷處理12 h，以水清洗無鹽酸后用來配制培養基），剛果紅0.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

1.1.3 試驗儀器DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱，寧波江南儀器廠；722S可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；FA2004N電子天平，河南兄弟儀器設備有限公司；HH-（S）6數顯恒溫水浴鍋，金壇市安普實驗儀器廠；SW-SJ-1F單人雙面潔凈工作臺，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SPX-150BSH-Ⅲ生化培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；移液槍，上海壘固儀器有限公司。

1.1.4 試驗用品錐形瓶（若干），培養皿（若干），接種環，酒精燈，1 000 μL規格移液槍，1 mL規格移液槍頭（若干），50～100 mL規格小燒杯（若干），滴管，血球計數板，酒精，無菌薄膜，脫脂棉，紗布，細線，標簽紙，廢報紙等。

1.1.5 試驗藥品葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉、麥芽糖、胰蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、牛肉膏、尿素、滅菌水、吐溫-80、NaOH溶液，酒石酸鉀鈉、結晶酚、無水亞硫酸鈉、磷酸氫二鈉液、3，5-二硝基水楊酸、羧甲基纖維素鈉（CMCNa）、1 g/mL標準葡萄糖液。

1.2 試驗方法

1.2.1 青霉的分離與鑒定在衡陽市的郊區及祁東縣采集稻田土壤樣本，經無菌水混合，充分振蕩，滅菌紗布過濾，靜置，上清液接種于濾紙條液體培養基進行富集培養3 d，取富集后的培養液涂布接種到PDA培養基平板（倒平板之前加100 μL/mL的青霉液和硫酸鏈霉素）上，恒溫培養，進行菌株分離，將分離純化得到的菌株活化并配制成孢子懸浮液，分別點接到剛果紅纖維素瓊脂培養基中，3次重復，恒溫培養，用十字交叉法測量菌落直徑和透明圈直徑。根據菌落生長狀態、透明圈大小、透明圈清晰程度及菌落和透明圈的比值，篩選菌株。用顯微鏡觀察菌絲及孢子梗形狀，并用油鏡觀察其孢子形態，參閱《中國真菌志》[14]等鑒定為青霉，命名為青霉1-4。

1.2.2 C源、N源的最優配方

1.2.2.1 青霉1-4孢子液的制備將青霉1-4接種于活化培養基上，于25℃培養5～6 d進行活化后，取10 mL無菌生理鹽水洗下孢子，加1滴吐溫-80打散孢子團塊，用血球計數板計數，調整孢子濃度至106個/mL，用于下面的接種試驗。

1.2.2.2 最適N源的篩選與比例分別以酵母粉、硫酸銨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素為N源，使加入的總N量為5%，加入10 g啤酒糟中，每種N源3個重復，接種青霉1-4，用封口膜封口，置于25℃恒溫箱中培養6 d，觀察菌株長勢，選出最優的N源。

根據試驗結果，設定啤酒糟的量和最優N源的比例分別為5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，40∶1等6個處理，即往6個35 g滅菌的啤酒糟中分別加入7.0，3.5，2.3，1.8，1.4，0.9 g最優N源混勻，每處理各分裝入已滅菌的3個培養皿（直徑90 mm）中，然后接種青霉1-4，用封口膜封口，置于25℃恒溫箱中培養6 d，觀察結果。

1.2.2.3 最適C源的篩選與比例取C源分別為淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖各0.5 g，加入10 g的啤酒糟中，每種C源3個重復，接種青霉1-4，用封口膜封口，置于25℃恒溫箱中培養6 d，觀察菌株長勢，選出最優C源。

根據試驗結果，設定啤酒糟的量和最優C源的比例分別為20∶1，25∶1，30∶1，35∶1，40∶1等5個處理，即往10 g滅菌的啤酒糟中分別加入0.5，0.4，0.33，0.29，0.25 g最優C源混勻，每處理各分裝入已滅菌的3個培養皿（直徑90 mm）中，然后接種青霉1-4，用封口膜封口，置于25℃恒溫箱中培養6 d，觀察結果。

1.2.2.4 C源、N源的最優配方根據試驗結果，設定啤酒糟的量，最佳C源、N源同啤酒糟的質量比例分別設為（20∶1，20∶1），（20∶1，25∶1），（20∶1，30∶1），（25∶1，20∶1），（25∶1，25∶1），（25∶1，30∶1），（30∶1，20∶1），（30∶1，25∶1），（30∶1，30∶1）9組進行處理，另設置一個不加C源、N源的空白對照組，每處理3個重復。每處理根據比例分別加入30 g啤酒糟中混勻，各分裝入已滅菌的3個培養皿（直徑90 mm）中，然后接種青霉1-4，用封口膜封口，置于25℃恒溫箱中培養6 d，觀察試驗。

1.2.3 酶活力與孢子數測定

1.2.3.1 試劑的配制DNS試劑：將6.3 g的3，5-二硝基水楊酸和2 mol/L NaOH溶液262 mL，加到500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結晶酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中保存，靜置7 d后使用。

pH值為5.0的檸檬酸緩沖液：制取0.2 mol/L磷酸氫二鈉液（稱取7.16 g磷酸氫二鈉溶解于蒸餾水中，定容至100 mL）和0.1 mol/L的檸檬酸液（稱取2.1 g檸檬酸溶解于蒸餾水中定容至100 mL），取磷酸氫二鈉液24.3 mL、檸檬酸液25.7 mL混勻。

羧甲基纖維素溶液：準確稱取2.0 g羧甲基纖維素鈉鹽溶于200 mL水中，沸水浴中加熱至溶化，過濾，取濾液100 mL，加檸檬酸緩沖液20 mL、蒸餾水40 mL，混勻，貯存于冰箱中備用。

1 mg/mL葡萄糖標準溶液：準確稱取80℃烘至恒質量的葡萄糖（AR）100 mg，置于小燒杯中，加入少量蒸餾水溶解后，轉移到100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL，混勻，4℃冰箱中保存備用。

1.2.3.2 葡萄糖標準曲線的制作取7支25 mL具塞刻度試管編號，分別加入質量濃度為1 mg/mL的葡萄糖標準液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，蒸餾水2，1.8，1.6，1.4，1.2，1.0，0.8 mL和DNS試劑1.5 mL，搖勻并在水浴中準確加熱5 min后取出，冰浴至室溫，蒸餾水定容至25 mL，加塞后混勻，在波長540 nm處測定光密度值，以光密度值為縱坐標、葡萄糖含量為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

1.2.3.3 羧甲基纖維素鈉酶活力的測定[15-16]各培養基中的啤酒糟及空白對照的啤酒糟加蒸餾水100 mL，40℃水浴振蕩浸提1 h，脫脂棉過濾，濾液于3500r/min下離心5min，上清液即粗酶液。25mL具塞試管中加入1.5 mL以pH值5.0檸檬酸緩沖液配制的1%羧甲基纖維素鈉溶液，置于50℃水浴中預熱5 min。加入0.5 mL粗酶液，搖勻，50℃準確反應40 min，之后加入DNS試劑1.5 mL，放入沸水浴顯色5 min，取出后立即置于冰水中冷卻至室溫，定容至10 mL，搖勻。在波長540 nm條件下測定其吸光值。

酶活單位的定義：上述反應條件下，每分鐘催化纖維素水解生成1 μg葡萄糖的酶量為1個酶活力單位，用U/mL表示。

其中，S為樣品平均吸光值在標準曲線上相對應的葡萄糖含量（mg）；D為定容的體積（mL）；V為參與反應的粗酶液體積（mL）；T為反應時間（min）。1.2.3.4孢子數的測定用生理鹽水洗脫下生長于啤酒糟培養基上（每皿1/8體積）的青霉孢子（每皿加入10 mL滅菌生理鹽水，用三角玻璃涂棒在菌落上輕輕劃動，使孢子洗下），加入一滴吐溫-80將孢子打散，取一滴用血球計數板在顯微鏡下計數。

使用1 mm×1 mm方格計數，25×16型的血球計數板計數公式：酵母細胞數（個/mL）＝80個小方格細胞總數/80×400×10 000×稀釋倍數×8。

2 結果與分析

2.1 N源的篩選

2.1.1 最適N源在分別加有酵母粉、硫酸銨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素5種不同N源的啤酒糟培養基中，于恒溫培養箱中25℃下培養5～6 d后，觀察青霉菌株的長勢發現，加入了硫酸銨、尿素、牛肉膏的啤酒糟比較濕潤黏稠，表面未見菌絲和孢子生長。對加入了酵母粉和胰蛋白胨的培養基進行對比發現，加入了胰蛋白胨的培養皿中青霉1-4的菌絲覆蓋啤酒糟的面積更加密集（圖1）。因此，最優N源為胰蛋白胨。

2.1.2 最適N源的比例確定根據已得知的最優N源，將等量啤酒糟與所加N源的量設置成梯度分別為5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，40∶1的培養基，于25℃恒溫培養箱中統一培養5～6 d，經觀察，胰蛋白胨為25∶1的培養基中白色絨毛狀的菌絲覆蓋密集度大于其他比例，而5∶1和10∶1這2個處理中的菌絲生長非常稀疏，明顯差于15∶1的處理，因而，將其中的4個生長較好的處理進行了拍照對比（圖2）。

為減少試驗誤差，按上述方法重復試驗，培養相同的時間，發現2次試驗都是一致的，25∶1含氮培養基中的青霉1-4長勢最好，所以，得出最適N源比例為25∶1。

2.2 C源的篩選

2.2.1 C源的篩選在分別加有葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖4種不同C源的啤酒糟培養基中，于恒溫培養箱中25℃下培養5～6 d后，觀察青霉菌株的長勢發現，加入了乳糖的啤酒糟中表面有覆蓋灰綠色絨毛狀的孢子，啤酒糟間還長有白色菌絲，其長勢比加入淀粉、葡萄糖、蔗糖的啤酒糟要明顯，所以，最優C源為乳糖，下一步將通過設定啤酒糟的量和最優C源的不同比例，來研究青霉1-4最適生長比例（圖3）。

2.2.2 最適C源的比例確定根據已得知的最優C源，將等量啤酒糟與所加C源的量設置成梯度分別為20∶1，25∶1，30∶1，35∶1，40∶1的培養基，于25℃恒溫培養箱中統一培養，經觀察，乳糖比例為30∶1，35∶1，40∶1的3組培養基菌絲和孢子長勢不明顯，所以，將乳糖比例為20∶1，25∶1以及空白對照組進行了對比拍照，發現乳糖為25∶1的培養基中基本被灰綠色絨毛狀的菌絲和孢子所覆蓋，而且蓋度大于乳糖20∶1以及空白對照組（圖4）。

為減少試驗誤差，按上述方法重復試驗，培養相同的時間，發現2次試驗都是25∶1的含C培養基中的青霉1-4長勢最好，所以，得出最適C源比例為25∶1。

2.3 N源、C源的最佳配比

根據篩選試驗結果可知，最優N源胰蛋白胨產青霉菌絲最多，其比例為25∶1，最優C源乳糖產青霉孢子數最多，其比例也為25∶1，將N源20∶1，25∶1，30∶1的比例與C源20∶1，25∶1，30∶1的比例混合交叉于等量啤酒糟中，于25℃恒溫培養箱中統一培養（圖5），根據測定各比例的啤酒糟的酶活力以及孢子數目，可得出適宜青霉生長的最優條件為胰蛋白胨比例25∶1，乳糖比例25∶1。

2.4 羧甲基纖維素鈉酶活力測定結果

2.4.1 葡萄糖標準曲線通過測定不同含量葡萄糖的吸光值，制作出葡萄糖的標準曲線（圖6），根據y＝0.441 4x＋0.091 6可以計算出待測液中的葡萄糖含量。

2.4.2 CMCNa酶活力測定在2.3試驗的10組培養皿中，觀察青霉的長勢情況，挑出一個長勢最好組（胰25∶1、乳30∶1），2個長勢較好組（胰30∶ 1、乳25∶1和胰25∶1、乳25∶1），一個長勢較差組（胰20∶1、乳25∶1）以及空白對照培養基，分別對其進行酶活力的測定。由表1可知，胰30∶1、乳25∶1組的酶活力最大，為476 U/mL，明顯高于外觀長勢好的CMCNa酶活力，即胰蛋白胨30∶1、乳糖25∶1混合時酶活力最高。

表1 酶活力的測定結果

2.5 不同培養基上青霉1-4產孢子數

通過血球計數板計數可知，外觀長勢最好組產孢子數量最多，為7.80×109個/mL，即胰蛋白胨為25∶1、乳糖為30∶1混合時孢子數最多（表2）。

表2 孢子數的測定

3 結論與討論

為提高青霉對啤酒糟的利用率，通過以啤酒糟為主料研究青霉的培養基配方，探究不同的N源、C源及其比例對青霉生長及酶活力的影響。本試驗結果表明，適宜青霉生長的最佳N源是胰蛋白胨，最適比例是25∶1；最佳C源是乳糖，最適比例是25∶1；N源胰蛋白胨與C源乳糖混合比為25∶1，30∶1時，產孢子數最多，為7.80×109個/mL，菌絲生長也最茂盛，但是其酶活力不及胰蛋白胨30∶1、乳糖25∶1組，胰蛋白胨25∶1、乳糖25∶1組和胰蛋白胨20∶1、乳糖25∶1組；N源胰蛋白胨與C源乳糖混合比為30∶1，25∶1時，CMCNa酶活力達到476 U/mL。顯示出菌絲生長的茂盛程度與其產生的孢子數成正比，但與酶活力并不成正比。表明青霉在基質條件適合下處于生長的旺盛時期，主要進行細胞的分裂與增生，因而，表現出分泌的酶類相對減少，可以根據使用目的選擇不同的培養基質。

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Optimization Study of the Penicillium Medium Formula with Brewer's Grains

BIN Dong-mei1，DAI Li-dan1，2，LI Yu-zhong1
（1.College of Life Science and Environment，Hengyang Normal University，Hengyang421008，China；2.Loudi No.1 Middle School，Loudi 417000，China）

To better utilize the brewer's grain,Penicilliumwith efficient degradation of cellulose was separated and screened from soil rich in cellulose.The paper chose some factors including different N source,C source and different proportion of inoculation amount after the activation of spore suspension ofPenicillium,observed mycelium growth situation and determined the number of spores and enzyme activity of strains,screened the optimal formula to promote the growth of the strain.The results showed that the best medium compositions were as follows:the optimal N source was tryptone,the optimal ratio of25∶1;the optimal C source was lactose,the optimal ratio of 25∶1;N source and C source were 25∶1 and 30∶1,respectively,and the mycelium growth was the most vigorous,the maximum number of spore was 7.80×109cells/mL,CMCNa enzyme activity was the highest up to476 U/mL.It shows that brewer's grain can be used as a good medium formula of the Penicillium,and it has a certain guiding significance for the selection of the efficient degradation of cellulose bacteria.

Penicillium sp.1-4;brewer's grains;Nsource;Csoure;cellulase

TS262.5

A

1002-2481（2016）02-0164-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.08

2015-11-03

湖南省自然科學基金省市聯合基金項目（14JJ5001）

賓冬梅（1970-），女，湖南衡陽人，教授，主要從事農產品開發與利用的教學及研究工作。