高效絮凝劑產生菌的分離選育及培養條件優化

張海，曲睿娟，李日強

（山西大學環境與資源學院，山西太原030006）

高效絮凝劑產生菌的分離選育及培養條件優化

張海，曲睿娟，李日強

（山西大學環境與資源學院，山西太原030006）

為了研究微生物產絮凝劑的最佳培養條件，由此提高微生物絮凝劑的絮凝率。以采集于山西省晉陽湖湖心島和平定縣玉米地10～15 cm深處土壤為試驗樣品，通過常規細菌分離和高嶺土懸濁液法，從中篩選出編號為PY-M3和PY-F6絮凝活性較高的2株菌株。優化培養試驗表明，菌株PY-M3的最佳培養條件為：培養時間72 h，碳源為葡萄糖，含量為2 g/50 mL，氮源為復合氮源，培養基初始pH值為7.0，培養溫度為30℃，搖床轉速180 r/min，碳氮比值45，接種量2%；在最佳培養條件下，其發酵液絮凝率從92.57%提高到94.43%。菌株PY-F6的最佳培養條件為：培養時間72 h，碳源為葡萄糖，含量為0.5 g/50 mL，氮源為酵母膏，培養基初始pH值為7.0，培養溫度為30℃，搖床轉速140 r/min，碳氮比值30，接種量3%；在最佳培養條件下，其發酵液絮凝率從95.95%提高到98.61%。

微生物絮凝劑；絮凝率；培養條件優化

微生物絮凝劑是一類由微生物或其分泌物產生的代謝產物，且高效、無毒、可消除二次污染的有機高分子物質[1-3]。由于微生物絮凝劑能夠克服無機絮凝劑和合成有機絮凝劑的多種缺陷，最終實現零污染排放，且安全無毒[4-5]，逐漸成為國內外新型水處理劑的研究熱點[6-8]，被稱為第三代絮凝劑。美國科學家Butterfield在1935年從活性污泥中首次篩選到了絮凝劑產生菌，Nakamuara[9]從1976年才開始深入對微生物絮凝劑的研究，最終以醬油曲霉（Aspergillums）原料生產了AJ7002微生物絮凝劑。高藝文等[10]從油田采出水中分離篩選出一株高效微生物產生菌GL-6，在碳源質量濃度為20 g/L、有機氮源質量濃度為0.5 g/L、初始pH值為7.0的發酵條件下，微生物絮凝劑對含油廢水中濁度的去除率為92.4%，絮凝效果明顯優于無機絮凝劑。張本蘭[11]從活性污泥中分離篩選出菌株P.alcaligenes，其產生的絮凝劑對氯霉素廢水的脫色率高達98%以上。

在實際應用中，由于微生物絮凝劑使用成本高、使用量大的弊端，制約了其發展應用。因此，尋找高效絮凝劑產生菌以及優化培養條件具有很重要的現實意義。本研究通過從土壤中篩選出絮凝活性較高的菌株，旨在通過優化其培養條件以提高絮凝率。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源樣品取自山西晉陽湖湖心島和平定縣玉米地10～15 cm土層的土壤。

1.1.2 試劑高嶺土，鹽酸，氫氧化鈉，硫酸銨，硝酸鈉，苯酚，乙醇，蔗糖，淀粉，乳糖，葡萄糖，尿素，蛋白胨，酵母膏等（均為分析純）。

1.1.3 主要儀器電子分析天平（FA3204B，上海精科天美貿易有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（ZDX-35B，上海申安醫療器械廠）；恒溫振蕩培養箱（HZQF160，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）；電熱恒溫培養箱（DHP-9272，上海一恒科技有限公司）；六連攪拌器（J6-1，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；pH計（MP511，上海三信儀表廠）；分光光度計（721，上海第三分析儀器廠）。

1.1.4 分離及保藏培養基[12]細菌分離培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂15～20 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2，121℃滅菌15 min。

放線菌分離培養基：KCl 0.5 g，K2HPO41 g，NaNO32 g，FeSO40.01 g，MgSO40.5 g，蔗糖30 g，瓊脂15～20 g，pH值自然，121℃滅菌15 min。

霉菌分離培養基：可溶性淀粉20 g，瓊脂15～20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，FeSO40.01 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2～7.4，121℃滅菌15 min。

發酵培養基[13]：葡萄糖20 g，尿素0.5 g，酵母膏0.5 g，（NH4）2SO40.2 g，K2HPO45 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，pH值7.0，蒸餾水1 000 mL，112℃滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 絮凝率的測定方法[14]向100 mL量筒中依次加入70mL蒸餾水，質量分數為1%的CaCl25mL，培養液2 mL，最后定容至100 mL。稱取0.40 g高嶺土放入200 mL的燒杯中，然后將量筒中的溶液加入燒杯，調節pH值到8.0左右。使用六連攪拌器以200 r/min速度攪拌30 s，再以50 r/min速度攪拌5 min，在靜置10 min后，使用分光光度計測定上清液在波長為550 nm處的吸光度，以蒸餾水代替CaCl2和培養液溶液，作為對照。計算待測樣品的絮凝率。

式中，A為對照上清液550 nm處吸光度；B為樣品上清液550 nm處吸光度。

1.2.2 微生物絮凝劑產生菌的分離篩選將樣品制成稀釋液分別接種于1.1.4的3種分離培養基中富集培養，然后將菌液稀釋成10-5，10-6，10-7倍，在相應的培養基平板上劃線，待菌落長出，再挑取單菌落于相應的平板培養基中純化。將分離出的菌株編號，然后接種到標有相應編號的發酵培養基中，在恒溫振蕩培養箱（120 r/min，溫度為30℃）中培養72 h進行初篩。再將初篩獲得的有絮凝活性的菌株預發酵液分別以2%接種量接入發酵培養基中，在恒溫振蕩培養箱（120 r/min，30℃）中培養72 h進行復篩，測定培養液的絮凝率。將絮凝率高的菌株作為后續試驗用菌株。

1.2.3 優化微生物產生絮凝劑的培養條件

1.2.3.1 培養時間對菌體生長及絮凝活性的影響將預發酵液以2%的接種量接種于8個150 mL三角瓶培養基中（每個三角瓶裝有50 mL發酵液培養基），在恒溫振蕩培養箱（120 r/min，30℃）中培養12，24，36，48，60，72，84，96 h。

1.2.3.2 菌體生長量的測定方法[15]稱量凈濾紙的質量A，用此濾紙過濾50 mL的培養液，并在105℃下烘干直至恒質量B，菌體的干質量即為二者的質量之差（B-A），并換算為質量濃度單位（g/L），表示菌體生長量。

1.2.3.3 不同碳源對菌株產生絮凝劑的影響[16]在培養基其他成分不變的條件下，分別用與原培養基碳原子含量相同的葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉和乙醇作為培養基的碳源。在恒溫振蕩培養箱（120 r/min，30℃）中培養72 h，確定最適碳源。

1.2.3.4 碳源含量對菌株產生絮凝劑的影響在培養基其他成分不變的條件下，每50 mL分別用0.5，1，1.5，2，2.5 g的葡萄糖作為微生物的碳源，在恒溫振蕩培養箱（120 r/min，30℃）中培養72 h，然后測定其絮凝率，確定最適碳源含量。

1.2.3.5 不同氮源對菌株產生絮凝劑的影響在培養基其他成分不變的條件下，分別用與原培養基氮原子含量相同的復合氮源：酵母膏、（NH4）2SO4、尿素、蛋白胨、NaNO3作為培養基的氮源。在恒溫振蕩培養箱（120 r/min，30℃）中培養72 h，確定最適的氮源。

1.2.3.6 初始pH值對菌株產生絮凝劑的影響在培養基其他條件不變的情況下，以不同的培養基初始pH值在恒溫振蕩培養箱（120 r/min，30℃）中培養72 h，確定最適初始pH值。

1.2.3.7 正交試驗優化其他培養條件利用正交試驗優化培養基初始碳氮比、培養溫度、搖床轉速和接種量。正交試驗因素水平列于表1。

表1 培養條件優化正交試驗因素與水平

1.2.3.8 最佳條件下菌株產生絮凝劑的絮凝率在最佳的培養條件下培養菌株，測定其優化條件下的絮凝率。

2 結果與分析

2.1 絮凝菌株的分離選育

試驗共分離純化出108株菌，通過初篩試驗，確定有8株菌具有絮凝活性，對其進行復篩并測定其絮凝率，結果列于表2。

表2 絮凝菌株復篩結果

從表2可以看出，絮凝率較高的2株菌分別為PY-M3和PY-F6，其絮凝率分別為92.57%和95.95%。因此，將PY-M3和PY-F6作為后續試驗的研究對象。

2.2 菌株產生絮凝劑培養條件的優化

2.2.1 培養時間對菌體生長及絮凝活性的影響從圖1可以看出，菌株PY-M3發酵液絮凝率與菌體生長量不具有相關性。菌株PY-M3的生長量在36～60 h生長最迅速，隨后進入穩定期，幾乎不再增加；而發酵液絮凝率在36～72 h中不斷提升，72 h達到最高，為91.2%，隨后下降，可能是由于菌體在后期生長過程中合成的某種分泌物降解了絮凝活性物質，從而導致絮凝率下降。從pH值的變化曲線可以看出，培養初期，pH值略有上升，從24 h開始，隨著培養時間的延長，pH值呈階梯性下降，可能是因為菌體會分泌某種堿性物質，所以初期pH值上升，而菌體利用碳源的過程中產生了酸，隨著培養時間的延長，菌體數目不斷增大，酸性物質也不斷增多，從而導致培養基pH值不斷下降。綜上所述，72 h為菌株PY-M3的最佳產生絮凝劑的時間。

從圖2可以看出，在72 h前菌體生長量迅速增加，發酵液的絮凝率隨菌體生長量的增加同步升高，在菌體生長穩定期84 h時，絮凝活性達到最高，絮凝率達96.2%。可以看出，菌體生長與絮凝活性物質的產生呈明顯的正相關，表明引起絮凝的活性物質是由微生物合成分泌到體外的，而不是細胞自融造成的[17]。當進入菌體生長的衰亡期，不再產生絮凝物質，絮凝率隨之也不再提升。pH值在整個培養過程中變化幅度不大，前48 h pH值下降，之后回升趨于穩定，這可能是由于微生物利用葡萄糖產生了酸，使pH值下降，而絮凝活性物質的增加伴隨某種堿性物質也不斷增加，又導致pH值升高；當菌體進入衰亡期，絮凝活性物質穩定不再增加，使得pH值趨于穩定。綜上所述，考慮到實際應用中的動力消耗，確定72 h為菌株PY-F6產生絮凝劑的最佳時間。

2.2.2 不同碳源對菌株產生絮凝活性物質的影響

由于不同碳源分子式不同，所以其碳原子質量分數也不同，為使碳原子含量與原培養基相等，所以不同碳源的取量不同（表3）。

表3 不同碳源取量

從圖3-a可以看出，對于菌株PY-M3，碳源為葡萄糖時絮凝率最高，達到91.89%；乳糖次之，絮凝率達到90.32%。所以，葡萄糖為菌株PY-M3的最佳碳源。

從圖3-b可以看出，蔗糖、淀粉和葡糖糖作為PY-F6的碳源時均有較高的絮凝活性，尤其是葡萄糖，其絮凝率高達95%，說明菌株PY-F6對碳源的適應性較廣。因此，菌株PY-F6的最佳碳源為葡萄糖。

2.2.3 不同氮源對菌株產生絮凝劑的影響氮源是微生物的重要組成部分，提供微生物細胞合成蛋白質的物質。不同氮源的分子式不同，其氮原子分子質量分數也不同，為使不同氮源的氮原子含量與原培養基相同，所以不同氮源的取量不同（表4）。

由圖4-a可知，復合氮源和酵母膏作為菌株PYM3的氮源時，其絮凝率較高，均超過90%；NaNO3和（NH4）2SO4作為氮源時，菌株PY-M3絮凝率較低，甚至不足80%。表明無機氮源不利于菌株PY-M3的吸收利用。綜合考慮，由于復合氮源價格低廉，所以，用復合氮源作為菌株PY-M3的最佳氮源。

從圖4-b可以看出，尿素、酵母膏、蛋白胨、復合氮源作為菌株PY-F6的氮源時，其絮凝效果均較好，絮凝率都達到了90%以上，尤其酵母膏，其絮凝率高達97%。所以，選擇菌株PY-F6的最佳氮源為酵母膏。

表4 各種氮源的取量

2.2.4 碳源含量對菌株產生絮凝劑的影響由圖5-a可知，隨著葡萄糖含量的增加，菌株PY-M3的絮凝率也不斷提升，在葡萄糖含量為2 g/50 mL時，其絮凝率最高，達到92.6%，隨后迅速下降。由圖5-b可知，菌株PY-F6隨著葡萄糖含量的增加，其絮凝率不斷提升，在葡萄糖含量為1.5 g/50 mL時，其絮凝率最高，達到97.5%，而在0.5 g/50 mL時，其絮凝率就已達到96.6%。綜合考慮，2 g/50 mL為PY-M3的最佳碳源含量；0.5 g/50 mL為PY-F6的最佳碳源含量。

2.2.5 發酵培養基初始pH值對菌株產生絮凝劑的影響由圖6-a可知，菌株PY-M3發酵液的絮凝活性受培養基初始pH值影響較大，當pH值為6.5～8.5時，該菌株產生的絮凝劑具有較好的絮凝活性，絮凝率達到90%；當pH值為7.0時，絮凝活性最高，絮凝率達92.6%；而在堿性條件下，該菌株產生的絮凝劑的絮凝活性受到嚴重抑制，絮凝率迅速下降，最低不足50%。所以，菌株PY-M3產生絮凝劑的最適pH值為7.0。

由圖6-b可知，菌株PY-F6發酵液的絮凝活性受培養基初始pH值影響相對較小，當pH值為4.5～8.5時，該菌株產生的絮凝劑均有較高的活性，其絮凝率維持在90%以上；當pH值為7.0時，其絮凝率最高，達到96.2%；但在過堿的條件下，其絮凝活性明顯受到抑制。因此，菌株PY-F6產絮凝劑的最適pH值為7.0。

2.2.6 正交試驗優化培養基成分配比和其他培養條件通過比較4個因素的R值可知，對菌株PY-M3產絮凝劑的影響程度由大到小依次為接種量＞搖床轉速＞培養溫度＞碳氮比值（表5）。

表5 菌株PY-M3培養條件優化正交試驗結果

從表6可以看出，接種量（因素D）對菌株PY-M3產生絮凝劑有顯著影響，另外3個因素對菌株產生絮凝劑沒有顯著差異，間接表明，該菌株對碳氮比、溫度、轉速有較寬的適應范圍。結合因素水平趨勢（圖7）和表5中的K值（各因素各水平絮凝率平均值）可知，各因素最佳水平是A3B2C3D2，即碳氮比值45，培養溫度30℃，搖床轉速180 r/min，接種量2%。

表6 菌株PY-M3正交試驗方差分析

通過比較4個因素的R值可知，對菌株PY-F6產生絮凝劑的影響程度由大到小依次為搖床轉速＞碳氮比＞培養溫度＞接種量（表7）。

表7 菌株PY-F6培養條件優化正交試驗結果

由表8可知，轉速（因素C）對菌株PY-F6產絮凝劑具有極顯著影響，碳氮比（因素A）和溫度（因素B）對菌株PY-F6產生絮凝劑具有顯著影響，接種量（因素D）影響不顯著。結合因素水平趨勢（圖8）和表7中的K值（各因素各水平絮凝率平均值）可知，各因素最佳水平是A2B2C2D3，即碳氮比值30，培養溫度30℃，搖床轉速140 r/min，接種量3%。

表8 菌株PY-F6正交試驗方差分析

2.2.7 最佳優化條件下菌株產生絮凝劑的絮凝率

從表2，9可以看出，菌株PY-M3在最佳條件下培養，其發酵液絮凝率從92.57%提高到94.43%；菌株PY-F6在最佳條件下培養，其發酵液絮凝率從95.95%提高到98.61%。

表9 最佳優化條件下菌株的絮凝率

3 結論

通過常規細菌分離法從樣品中共分離出108株菌體，并采用高嶺土懸濁液檢驗其絮凝能力，進而得到8株具有絮凝能力的菌體。在此基礎上，進行復篩，最終獲得2株絮凝能力強且穩定性好的菌株：PY-M3和PY-F6。

菌株PY-M3的最佳培養條件為：培養時間72 h；碳源為葡萄糖，含量為2 g/50 mL；氮源為復合氮源；培養基初始pH值為7.0；培養溫度為30℃；搖床轉速180 r/min；碳氮比值45；接種量2%。在最佳培養條件下，其發酵液絮凝率從92.57%提高到94.43%。菌株PY-F6的最佳培養條件為：培養時間72 h；碳源為葡萄糖，含量為0.5 g/50 mL；氮源為酵母膏；培養基初始pH值為7.0；培養溫度為30℃；搖床轉速140 r/min；碳氮比值30；接種量值3%。在最佳培養條件下，其發酵液絮凝率從95.95%提高到98.61%。

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Isolation and Breeding of High Efficient Flocculant Producing Strains and Optimization of Its Culture Conditions

ZHANG Hai，QU Rui-juan，LI Ri-qiang
（College of Environment and Resources，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

The study was undertaken to investigate the best culture conditions of flocculant producing microbial,thus increasing flocculating rate.The samples were collected from10-15 cm depth corn-soil in Jinyang lake and Pingding county in Shanxi province.By routine bacteria separation and Kaolin suspension method,two effective strains PY-M3 and PY-F6 were screened.Optimization of PY-M3 culture condition test showed that culture time was 72 h;the most suitable carbon source was glucose,with 2 g/50 mL concentration;nitrogen source was complex nitrogen and C/N was 45;medium initial pH was 7;culture temperature was 30℃;agitation rate was 180 r/min and inoculation quantity was 2%.Under the best culture conditions,flocculation rate increased from 92.57%to 94.43%.Optimization of PY-F6 culture condition test showed that carbon source was glucose,with 0.5 g/50 mL;nitrogen source was yeast extract and C/Nwas 30;culture time was 72 h;medium initial pH was 7;culture temperature was 30℃;agitation rate was 140 r/min and the inoculation quantity was 3%.As a result,the flocculation rate was increased from95.95%to98.61%.

microbial flocculant;flocculantion rate;culture condition optimization

X172

A

1002-2481（2016）02-0222-07

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.24

2015-11-19

張海（1988-），男，山西太原人，在讀碩士，研究方向：環境工程水處理。李日強為通信作者。