奶牛乳腺炎主要病原菌PCR檢測方法

武守艷，韓一超，陳劍波，楊麗華，董春光，韓文儒，夏艷婷

（山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西太原030032）

奶牛乳腺炎主要病原菌PCR檢測方法

武守艷，韓一超，陳劍波，楊麗華，董春光，韓文儒，夏艷婷

（山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西太原030032）

針對引起奶牛乳腺炎的3種主要病原菌無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌設計了3對特異性引物，通過對單一細菌PCR擴增條件的優化、特異性和敏感性研究，確立了對這3種病原菌特異、敏感、快速的PCR鑒定和檢測方法，為進一步建立奶牛乳腺炎主要病原菌多重PCR診斷方法奠定了基礎。

奶牛乳腺炎；主要病原菌；PCR；金黃色葡萄球菌；無乳鏈球菌；大腸桿菌

奶牛乳腺炎是危害奶牛業的一種世界性疾病，此病的發生是由于乳腺受到直接物理、化學的刺激、病原微生物的侵襲及飼養管理不當引起的炎性變化[1]。由于它的發病原因比較復雜，給防治帶來很大困難，該病危害嚴重，不僅會降低奶牛的產奶量和牛奶品質，同時牛奶中的細菌毒素還會影響人體健康。

據調查，近年來山西省某些奶牛場引起奶牛乳腺炎的主要病原菌有乳房鏈球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和洋蔥伯克霍爾德菌等[2]，且在臨床上以不表現癥狀的隱性型多見，感染的細菌種類也較多。因而，在臨床診斷和病原菌鑒定方面有很大的困難；盡管目前國內外對臨床采集的樣品中病原菌的檢驗，大部分仍采用所謂的“金標準”（細菌培養）法，即采集標本后，先接種增菌培養液增菌，再分離單個菌落進行細菌鑒定，該方法雖然比較準確，但是診斷過程耗時較長且敏感性較低，細菌培養易受其生理條件和抗生素使用的限制，故難以滿足臨床需求[3-4]。隨著分子生物學技術的發展，PCR技術在病原菌的檢測方面得到了廣泛的應用，并且展現出快速、特異的優勢和前景[5]。

本研究在對山西省奶牛乳腺炎流行病學調查研究的基礎上，針對引起奶牛乳腺炎的3種主要病原菌無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌設計了3對特異性引物，通過對PCR擴增條件的優化、特異性和敏感性研究，建立了對這3種病原菌的快速、敏感、特異的PCR檢測和鑒定方法，從而為進一步建立奶牛乳腺炎主要病原菌多重PCR診斷方法奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株

供試標準菌株無乳鏈球菌（CCM55934）、金黃色葡萄球菌（ATCC29062）、大腸桿菌（ATCC12079）以及對照標準菌株沙門氏菌（CCM3572）均購自中國獸藥監察所；被檢菌株是從奶樣中分離并鑒定的金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌，均由山西省農業科學院畜牧獸醫研究所奶牛乳腺炎快速診斷技術研究課題組分離保存。

1.2 主要儀器及試劑

主要儀器有分析天平、臺式高速離心機、水浴鍋、真空干燥器、PCR擴增儀、電泳儀、超凈臺、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、微波爐、-20℃冰箱、可調移液器（2，20，200，1 000 μL），均由山西省農業科學院畜牧獸醫研究所獸醫臨床醫學研究室提供。

主要試劑有10×PCR buffer、瓊脂糖、rTaqDNA聚合酶、Marker、飽和酚、dNTPs及其他試劑，均購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司。

1.3 引物設計

根據GenBank已發表的編碼16S～23S rRNA的DNA序列設計引物，經比對后確定引物具有良好的特異性，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如表1所示。

表1 病原菌PCR引物設計結果

1.4 細菌DNA提取

將3種細菌菌株分別接種于LB液體培養基中，于37℃培養過夜；然后將菌液于5 000 r/min（4℃）離心后棄上清，將殘余液滴吸干凈后，加入500 μL TE（10 mmol/LTris HCl，0.5 mmol/LEDTA，pH值8.0），加30 μL 10%SDS和3 μL 10 mg/mL的蛋白酶K；55℃溫育1 h；加入等體積的酚、氯仿、異丙醇混勻，5 000 r/min離心10 min，棄上清后加入等體積的氯仿、異丙醇混勻，5 000 r/min離心10 min，棄上清后加入1/10體積的3 mol/L的乙酸鈉（pH值5.2）和核糖核酸酶A，37℃下輕搖30 min后加入2.5倍體積的無水乙醇，-20℃放置2 h，10 000 r/min離心15 min棄上清，再用70%乙醇洗滌2次，超凈臺內風干沉淀，重新溶于50 μL TE中，-20℃保存備用。

1.5 PCR條件的優化

用普通PCR方法分別對大腸桿菌（ATCC12079）、無乳鏈球菌（CCM55934）、金黃色葡萄球菌（ATCC29062）檢測，依次對退火溫度、引物濃度、dNTP濃度等條件進行優化探索，以便提高PCR擴增效果。同時進行細菌PCR特異性和敏感性試驗，反應體系均為20 μL。

1.63 種細菌單重PCR方法的特異性試驗

將試驗用標準菌株、被檢菌株及對照菌株分別在培養基上增菌后按1.4方法提取細菌DNA，制備模板，然后按優化后的PCR擴增條件進行擴增，以確定細菌PCR方法的特異性。

1.73 種細菌單重PCR的靈敏性試驗

將3種病原菌接種于相應的液體培養基中，37℃振搖培養18～24 h[6]，于OD600測菌體濃度，使菌液倍比稀釋成10～107的數量級。同時將不同稀釋濃度的菌液按1.4方法提取細菌DNA，制備模板，按優化后的條件進行PCR擴增，根據cfu濃度與擴增結果的比對，確定各病原菌PCR方法的靈敏性。

1.8 電泳檢測

稱4 g瓊脂糖放于500 mL錐形瓶中，加入50倍稀釋的TAE電泳緩沖液200 mL，于微波爐中熔解，再加入10 μL染色液混勻，配制成2%的瓊脂糖凝膠。在電泳槽內放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR擴增產物5 μL混合1 μL上樣緩沖液，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110～120 V電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察記錄結果。

2 結果與分析

2.1 PCR退火溫度的優化試驗結果

在普通PCR方法的基礎上分別以3種代表菌株進行PCR擴增的退火溫度條件的優化試驗。結果表明，無乳鏈球菌菌株退火溫度在47.5～57.5℃均可擴增出相應條帶，以49.0～55.0℃擴增效果最佳；金黃色葡萄球菌菌株退火溫度在49.5～59.0℃均可，以55.5～57.5℃擴增效果最佳；大腸桿菌菌株的退火溫度在45.5～60.5℃均可，以46.0～53.5℃擴增較為理想（圖1～3）。

2.2 PCR擴增引物濃度的優化試驗結果

將無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌引物終濃度在0.25～2.75μmol/L、大腸桿菌在0.125～1.5μmol/L稀釋成共10個稀釋度。利用優化后的退火溫度分別對3種病原菌PCR擴增的引物濃度進行優化，結果表明，無乳鏈球菌的引物終濃度在1.25～2.75 μmol/L均可，以1.5～1.75 μmol/L效果為佳；金黃色葡萄球菌引物終濃度在1.0～2.75 μmol/L均可，以1.25～2.0 μmol/L效果為好；大腸桿菌的引物終濃度在0.5～1.5 μmol/L均可，以0.75～1.0 μmol/L效果為佳（圖4～6）。

2.3 PCR擴增dNTP濃度的優化試驗結果

試驗將dNTP終濃度設為0.025～0.275 mmol/L共11個梯度，利用優化后的退火溫度和引物濃度分別以3種代表菌株進行PCR擴增的dNTP濃度優化。結果表明，擴增無乳鏈球菌時，dNTP終濃度在0.075～0.2 mmol/L均可，以0.1～0.2 mmol/L為佳；擴增金黃色葡萄球菌時，dNTP終濃度以0.1～0.2 mmol/L為適宜，0.125～0.175 mmol/L為最佳；擴增大腸桿菌時，dNTP終濃度在0.075～0.275 mmol/L均可（圖7～9）。

2.4 PCR擴增特異性試驗結果

將3種標準菌株和從臨床乳腺炎牛奶樣品中分離鑒定的同種菌株以及試驗中的對照菌，按照優化后的PCR擴增條件，分別以自身的引物進行單重PCR擴增，結果表明，在162，439，544 bp處出現了與試驗設計相符的擴增片段，對照菌未出現擴增片段（圖10）。

2.5 PCR擴增的敏感性試驗結果

將不同稀釋濃度的菌液提取細菌DNA，制備模板后，按照優化后的條件進行PCR擴增，結果表明，無乳鏈球菌擴增的靈敏性為104cfu/mL，金黃色葡萄球菌擴增的靈敏性為105cfu/mL，大腸桿菌的靈敏性為103cfu/mL（圖11～13）。

3 討論

長期以來，奶牛乳腺炎一直困擾著奶牛業的發展，奶牛乳腺炎的研究也成為世界性的熱點，無論在預防、治療及診斷方面都做了大量的工作，尤其是對奶牛乳腺炎的診斷、檢測方法的研究更是如此，常用的對奶牛乳腺炎的診斷方法有病原微生物檢查法、乳汁體細胞檢查法、乳汁pH值檢查法及乳汁導電性檢查法等，這些方法都可以作為初步診斷，但是進一步確診需要進行病原微生物的分離和鑒定[1]。病原微生物分離和鑒定盡管較為準確，但敏感性較低和耗時較長，再者對于隱性乳腺炎病料的細菌培養常出現假陰性[7]；PCR技術的應用彌補了細菌學培養的不足，該技術在病原菌的診斷上極大地節省了時間，在數小時內就可以檢測出來，尤其是建立多重PCR方法后既能節省試劑的用量又能縮短檢測時間[8]。

本試驗中細菌的引物設計選擇在16S～23S rRNA區間，因為這個區間是一個非功能性的保守區間[9]，也越來越多的被用來鑒別種屬關系較近的細菌，選用16S～23S rRNA區間進行引物的設計，可以較好地鑒別出種屬進化關系較近的細菌[10]。以此為依據，設計出相應的主要病原菌PCR擴增引物，通過試驗研究證實了這3對引物既具有良好的代表性，又具有良好的特異性。

本試驗為了便于觀察結果，在引物的設計上遵循使得3對引物擴增的核酸片段長度呈梯度出現的原則，設計為不同大小，即無乳鏈球菌162 bp、金黃色葡萄球菌439 bp和大腸桿菌544 bp，這樣使得結果判定更加直觀、簡便和實用，同時也為多重PCR檢測和鑒定方法的建立奠定了一定的基礎，通過對退火溫度、引物濃度、dNTP濃度等條件的優化，及病原菌PCR擴增的特異性、敏感性研究，驗證了該方法具有快速、特異性強的優點，可以用于對引起奶牛乳腺炎的這3種主要病原體的檢測和鑒定。

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［2］武守艷，韓一超，陳劍波，等.山西省奶牛乳腺炎病原菌調查研究[J].中國奶牛，2013（16）：28-30.

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［5］布日額，郎景民，華育平，等.牛乳中無乳鏈球菌PCR快速檢測方法的建立[J].中國奶牛，2009（8）：17.

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Study on PCR Method for the Detection of the Pathogenic Bacteria of Dairy Mastitis

WU Shou-yan，HAN Yi-chao，CHEN Jian-bo，YANG Li-hua，DONG Chun-guang，HAN Wen-ru，XIA Yan-ting
（Institute of Animal Husbandry&Veterinary，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030032，China）

According to 3 kinds of main pathogenic bacteria of dairy mastitis—Streptococcus agalactiae,Staphylococcus aureus and Escherichia coli,3 pairs of specific primers were designed,PCR conditions of of single bacteria was optimized,specificity and sensitivity of PCR detection method were researched.A rapid,sensitive,specific PCR method for 3 kinds of main pathogenic bacteria was established,which lay a foundation for further establishment of the main pathogenic bacteria of dairy cow mastitis diagnosis of multi PCR method.

dairy mastitis;main pathogenic bacteria;PCR;Streptococcus agalactiae;Staphylococcus aureus;Escherichia coli

S858.237.2＋6

A

1002-2481（2016）02-0232-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.26

2015-10-16

山西省科技攻關項目（20100311045，20150311017-3）；山西省農業科學院重點項目（YZD1514）

武守艷（1969-），女，山西盂縣人，副研究員，主要從事獸醫臨床醫學科學研究工作。韓一超為通信作者。