高粱苯丙氨酸解氨酶（SbPAL）編碼蛋白的生物信息學分析

張曉瑛，劉寶玲，郝青婷，薛金愛

（1.山西省農機局，山西太原030002；2.山西農業大學農學院，山西太谷030801）

高粱苯丙氨酸解氨酶（SbPAL）編碼蛋白的生物信息學分析

張曉瑛1，劉寶玲2，郝青婷2，薛金愛2

（1.山西省農機局，山西太原030002；2.山西農業大學農學院，山西太谷030801）

高粱是世界上一種重要的糧食作物，具有耐寒耐高溫等優良性質，挖掘高粱抗病基因（如PAL），在基因水平上進行遺傳改良，提高高粱對貧瘠土地的耐受性仍是研究熱點之一。以高粱的苯丙氨酸解氨酶基因（SbPAL）為研究對象，運用生物信息學方法對其編碼蛋白的結構、理化性質及功能結構域進行分析，以期揭示苯丙解氨酶的基本信息。結果表明，高粱SbPAL基因的編碼序列（Codingsequences，CDS）全長為2 145 bp，編碼714個氨基酸；高粱SbPAL蛋白主要位于細胞基質中，二級結構以無規則卷曲和α－螺旋為主，三級結構預測其為同源四聚體結構，由4個相同亞基對稱性組成，各亞基之間由配體DTT共價連接。多序列比對結果表明，高粱SbPAL蛋白與擬南芥、水稻、葡萄、煙草等蛋白的同源性較高，為83.31%，SbPAL基因與玉米、水稻和大麥有著較近的親緣關系，PAL在這些作物中主要參與木質素和植保素的合成。此分析結果將為后續進一步研究SbPAL對木質素、植保素等合成的分子機制與抗病性關系奠定一定的理論基礎。

高粱；苯丙氨酸解氨酶；木質素；抗病性；生物信息學

植物的抗病性在一定程度上是植物與使其致病的病原微生物在長期的協同進化環境中相互適應和選擇所形成的一種可遺傳的特性[1]。植物受到病原物的侵染后，會產生一定的自身防御反應和生理變化，包括合成并積累木質素等抗病物質，而木質素是苯丙烷類代謝途徑中的產物之一，與植物的抗病性密切相關。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC 4.3.1.24）是一種主要存在于細胞質能夠催化L-苯丙氨酸非氧化脫氨生成反式肉桂酸（E-cinnamic acid，CA）的限速酶，也是苯丙烷類物質合成途徑中的第1個關鍵酶[2-4]。反式肉桂酸是植保素、木質素、類黃酮、花青素及某些酚類等生物合成所通用的前體[5-6]。有研究發現，由苯丙氨酸解氨酶調控生成的次生代謝產物還影響著植物的生長發育、色素合成等代謝過程[7]。此外，苯丙氨酸途徑還被用來減少細胞壁木質素的合成，以此將大量生物質轉化為更多的生物燃料[8]。因此，苯丙氨酸解氨酶在植物病理學及其抗逆方面都有著非常重要的研究地位[9]。目前，在很多植物中發現，并克隆研究了保守性較強的PAL基因，例如毛果楊（Populus trichocarpa）[10]、水稻（Oryza sativa）[1]、黃瓜（Cucum issativus）[11]、甜櫻桃（Prunus avium）[12]、葡萄（Vitis vinifera）[13]、煙草（Nicotiana tabacum）[14]和大豆（Glycine max）[15]。

高粱（Sorghum bicolor L.）是世界上一種重要的耐旱性糧食作物，有著優良的耐旱耐高溫性[16]。由于不同環境中存在的病蟲害會對高粱的產量和品質造成巨大威脅，因此，研究高粱抗病害的分子機制和遺傳改良迫在眉睫，而作為控制與抗病性相關的次生代謝產物合成的PAL防御基因則可被優選為良好的調控靶點。近幾年來，隨著高粱的基因組[17]和轉錄組[18]測序的完成，利用生物信息學方法從序列出發，經過先預測后驗證的方法來摸索具體分子機制的突破口已經成為研究熱點。

本研究利用生物信息學的方法，對高粱SbPAL基因的核苷酸以及相應氨基酸序列的理化性質、活性位點、結構特征和系統發育等方面進行了預測性分析，旨在為今后深入研究高粱SbPAL蛋白的具體催化特性及其植物病害脅迫的分子機制提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 數據來源

高粱SbPAL基因cDNA序列及其蛋白序列（Genbank號：NC_012873/XP_002454200）及另外13種植物的PAL蛋白序列均來源于NCBI（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Genbank數據庫，這13種植物的蛋白序列分別為：水稻（Oryza sativa）（AAO72666）、陸地棉（Gossypiumhirsutum）（AER12109）、玉米（Zea mays）（NP_001105334）、槿麻（Hibiscus cannabinus）（AFN85669）、紫蘇（Perilla frutescens）（AEZ67457）、黃瓜（Cucumis sativus）（AER58180）、馬鈴薯（Solanumtuberosum）（AGT63063）、葡萄（Vitis vinifera）（AEX32790）、野生大豆（Glycine soja）（ACT32033）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）（AAC18870）、蓖麻（Ricinus communis）（AGY49231）、煙草（Nicotiana tabacum）（AAA34122）、大麥（Hordeum vulgare）（BAJ97194）。

1.2 數據分析方法

用ExPasy網站提供的ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）工具分析蛋白理化性質。通過在線工具Target P 1.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/）來查看該蛋白的亞細胞定位；對該酶蛋白的跨膜結構和疏水性分析分別使用在線網站TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）；通過使用Conserved Domains網站（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）來分析該蛋白是否具有典型的苯丙氨酸解氨酶特征結構；使用SWISS-MODEL網站（http://swissmodel.expasy.org/）來預測SbPAL的三級結構進行同源建模，3D模型在Rasmol軟件查看。利用Genedoc軟件對高粱SbPAL蛋白和另外13種蛋白序列進行同源性比對；利用MEGA7.0軟件將高粱SbPAL蛋白與13條來自不同植物的PAL蛋白進行Clustal W多序列比對，并生成.meg格式的比對文件。然后，采用鄰接法（Neighbor-Joining，N-J）在.meg比對文件基礎上構建無根系統發育樹，自舉檢驗值設為1 000個循環，采用p-distance模式。

2 結果與分析

2.1 高粱SbPAL蛋白序列的理化性質分析

高粱SbPAL基因的編碼序列全長為2 145 bp，利用在線開放閱讀框ORF Finder工具，其開放閱讀框（ORF）長2 144 bp，得到的氨基酸序列全長為714 aa，起始密碼子和終止密碼子分別為ATG和TGA。高粱SbPAL基因編碼的蛋白含有C，H，N，O和S共5種原子，且分子式為C3375H5436N952O1030S31，相對分子質量為76.82 kD，理論等電點為6.05，摩爾消光系數為37 590，肽鏈長為671 aa，酸性氨基酸有81個，堿性氨基酸為73個，總之，帶電荷的氨基酸在總氨基酸占比為21.57%，含量較高的氨基酸有5種，即Ala，Leu，Val，Cly，Glu，其所占比例分別為12.5%，10.2%，7.4%，8.3%，8.0%。該蛋白不穩定指數為33.52，在生理條件為穩定蛋白（一般小于40視為穩定）。

2.2 高粱SbPAL蛋白的基本結構分析

經TargetP 1.1分析，高粱SbPAL蛋白位于細胞質基質中，沒有任何轉運肽（cTP：0.087＜0.73，mTP：0.163＜0.86，SP：0.045＜0.43。前者數值為預測值，后者數值為閾值）。通過TMHMM工具進行跨膜分析，該蛋白不存在跨膜現象，也沒有信號肽剪切位點（圖1），說明該蛋白在細胞質核糖體上合成后直接留到了細胞質中，并發揮其催化功能；用Protscale網站分析其疏水性（圖2），此蛋白主要有2個較長的疏水區，氨基酸位置分別為150～214 aa和256～291 aa，此外還有一些較短、數目較多的疏水區，總體疏水區域不是很明顯，與無跨膜區相一致，其位于SbPAL蛋白核心處，共同組成酶催化中心，進行催化反應。此肽鏈在280位置亮氨酸（Leu）處有最高得分值（2.711），即疏水性最強；在483位置谷氨酰胺（Gln）處有最低得分值（-2.578），親水性較強。

2.3 高粱SbPAL蛋白序列的高級結構分析

通過對高粱SbPAL氨基酸序列的二級和三級結構進行預測性分析發現，其二級結構（圖3）中主要有α-螺旋和無規則卷曲，分別占50.56%和42.58%，而延伸片段占比很少，僅為6.86%。通過在線網站Swiss-model工具對高粱SbPAL三級結構進行同源建模，預測到的三級結構如圖4所示，使用歐芹（Petroselinum Crispu）苯丙解氨酶（PcPAL）蛋白作為模板[19]，該蛋白與高粱SbPAL蛋白序列相似性為75.99%，且保守序列包括范圍為23～714 aa，覆蓋度為99%。利用X-射線晶體衍射發現該蛋白有同源四聚體，由4個相同的亞基組成，這些亞基通過與4個配體（2，3-二羥基-1，4-二硫代丁烷，簡稱DTT）形成共價鍵而連接到一起。這些配體有著小分子結構（圖4-C，4-D），兩端各含一個巰基（-SH），中間含2個羥基（-OH），而巰基能與亞基上的巰基形成二硫鍵，維系著亞基之間的穩定結構，而羥基的親水性，則可以使各亞基之間保持著一定的空隙，方便底物分子結合進入催化中心，從而更好地發生化學反應。這些連接到一起的亞基上的部分氨基酸共同組成酶與底物結合中心和催化中心，催化著L-苯丙氨酸斷裂C-N鍵，從而非氧化脫氨基形成E-肉桂酸。對比圖4-A和圖4-B三級結構，高粱的SbPAL蛋白也為同源四聚體，相同的亞基對稱性排列，其結構外形（呈蝶形）與歐芹PcPAL蛋白（呈橢圓形）略有差別，但其催化中心和與配體結合部位大致相似，配體與4個亞基結合部位均位于同源四聚體的中心部位（圖4-B）。

2.4 高粱SbPAL基因的氨基酸多序列比對分析

使用Genedoc軟件對高粱SbPAL與另外13種PAL蛋白進行多序列比對分析可知，這些植物的PAL蛋白與高粱SbPAL蛋白均具有較高的同源性，序列一致性可達到83.31%?？梢姡琍AL蛋白的功能區極其保守，但是肽鏈的N端（圖5）在序列長度和氨基酸組成上有著很大的差異，且因物種不同而序列差異大小都不相同。推測可能由于苯丙烷類合成途徑是植物從初生代謝轉向次生代謝過程中重要通路，PAL作為苯丙烷類次生代謝產物合成過程中的首要關鍵酶，其序列的穩定遺傳性和物種間進化趨同性明顯表現出其結構與功能之重要性[20]。

另外，多序列比對中發現，高粱SbPAL蛋白也和其他物種蛋白一樣，在215 aa處有連續的Ala-Ser-Gly三肽序列，此序列能夠通過自身脫水環化形成3'5-二氫-5-亞甲基-4H-咪唑-4-酮（MIO）結構，此結構在水稻OsPAL蛋白中緊鄰底物結合位點，負責催化E-肉桂酸酯/氨的生成[21-22]，且此結構與PAL和HAL（組氨酸解氨酶）中的典型MIO結構相同。

2.5 高粱SbPAL蛋白系統進化分析

進化樹用MEGA 7.0軟件在Clustal W多序列比對基礎上，運用鄰接法（Neighbor-Joining，即N-J法）設置，重復循環數為1 000，構建系統發育樹（圖6）。依據系統發育關系，可大體劃分為A，B，C共3類。在C組，高粱SbPAL蛋白與同屬禾本科的玉米、水稻和大麥的PAL蛋白聚在一起，且有的聚類值達到100，說明這些PAL蛋白更多參與著木質素及植保素等的合成，在生物脅迫和非生物脅迫下對其抗逆性（包括抗病）起著至關重要的作用。而A，B組PAL蛋白可能在類黃酮、花青素（如紫蘇）和多酚類物質（如馬鈴薯、煙草）等代謝過程中起著重要調控作用。植物間這種序列、結構和功能分化如此明顯的現象與各物種在漫長進化過程中適應不同環境的能力有著密切的聯系。

3 討論與結論

苯丙氨酸解氨酶主要存在于植物和真菌中，是苯丙烷類代謝途徑中的第1個限速酶，催化L-苯丙氨酸轉化為E-肉桂酸，從而形成木質素、植保素和酚類等一系列抗病性次生代謝產物。有研究表明，當植物受到病原體侵染時，PAL基因的表達量會顯著增加，抗病代謝產物也會相應積累。分析表明，高粱SbPAL蛋白相對分子量為76.82 kD，分子量明顯小于正常的PAL蛋白（一般為220～330 kD）[23]，其活性最適pH值為6.05，且含有大量的中性小分子氨基酸，如Ala，Gly和Leu，使得SbPAL蛋白分子量很小。苯丙氨酸解氨酶（PAL）屬于芳香環解氨酶類I_like超家族的成員之一，與組氨酸解氨酶（PAL）催化特點極其相似，都催化β-消除反應及非氧化脫氨，且其只有在同源四聚體形式時才具有催化活性。該酶的4個活性位點由3個不同亞基上的氨基酸共同組成，且其所在部位形狀不斷發生適應性變化，使得各亞基能夠相互配合，有條不紊地與底物結合，催化發生化學反應，然后再釋放，重新接收新的底物。這些關鍵氨基酸在錦紫蘇中為處于不同位置的酪氨酸（Y103）和甲硫氨酸（M335和M545），說明SsPAL和PcPAL類似，均為功能蛋白[24]，而高粱SbPAL蛋白的三級結構和歐芹PcPAL結構極為相似，很有可能也有類似的流動型酪氨酸和甲硫氨酸，并且參與著重要的催化功能。本研究對SbPAL單個蛋白所進行的一系列生物信息學分析，將為后期繼續研究高粱苯丙氨酸解氨酶家族基因通過調控植保素和木質素等的含量，以間接參與高粱抗病性等研究提供一系列理論基礎。從序列角度進一步解析基因及其蛋白結構特征，以期找到重要的靶位點，從而在分子水平上對高粱的抗病性進行遺傳改良，獲得抗病蟲害植株，增加其耐逆性，最終提高作物產量。因此，本研究所做的一系列上游分析對后期實驗理論指導有著重要的參考價值。

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Bioinformatics Analysis of Phenylalanine Ammonia-lyase（SbPAL）Protein-coding in Sorghum

ZHANGXiaoying1，LIUBaoling2，HAOQingting2，XUE Jin'ai2
（1.Agricultural Bureau of Shanxi Province，Taiyuan 030002，China；2.College of Agronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Sorghum is an important food crop in the world,it can resist cold as well as hot temperature and has other excellent properties.Mining resistance genes（such as PAL）and geneticly modifying it at the gene level in sorghum to improve its tolerance of sorghum on marginal land is still one of the hot topics in research field.In this paper,sorghum phenylalanine ammonia-lyase gene（SbPAL）was seen as the subject and was studied by using the method of bioinformatics to analyze its structure of the encoded protein, physicochemical properties and functional domains,to reveal the basic information of phenylalanyl ammonia-lyase.The results showed that coding sequence of sorghum SbPAL gene（CDS）had a total length of2 145 bp,encoding 714 amino acids.Sorghum SbPAL protein was mainly located in the extracellular matrix.Its secondary structure concluded random coil and α-helix and the three-dimensional structure which had a homologous tetramer.Four identical subunits made up the symmetry structure which was connected by covalent ligands DTT between two subunits.The multiple sequence alignment results showed that they had a closer relationship between sorghum SbPAL and other protein of various species,such as Arabidopsis,rice,grapes,tobacco,and high homology whose value was 83.31%.The SbPAL gene shared closer relationship between maize,rice and barley in which PAL was mainly involved in the synthesis of lignin and phytoalexin.The result of this analysis will lay a theoretical foundation for further study of the molecular mechanisms of SbPAL involving in synthese of lignin and phytoalexins related to disease resistance.

sorghum（Sorghum bicolor L.）;phenylalanine ammonia-lyase（SbPAL）;lignin；disease resistance;bioinformatics

S514

A

1002-2481（2016）11-1584-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.02

2016-06-14

山西農業大學引進人才科研啟動項目（2014ZZ06）

張曉瑛（1981-），女，山西五寨人，農藝師，碩士，主要從事昆蟲天敵與害蟲綜合防治研究工作。薛金愛為通信作者。