中國漢族大皰性皮膚病GLCCI1變異體與糖皮質激素不敏感無相關性

杜甜甜 付希安 孫勇虎 于功奇 王真真 楊寶琦 盧憲梅 劉 紅 張福仁

·短篇論著·

中國漢族大皰性皮膚病GLCCI1變異體與糖皮質激素不敏感無相關性

杜甜甜1，2付希安1孫勇虎1于功奇1王真真1楊寶琦1盧憲梅1劉 紅1張福仁1

目的： 應用基因分型技術分析中國漢族種群大皰性皮膚病GLCCI1變異體與糖皮質激素不敏感的相關性。方法： 將187例大皰性皮膚病患者根據控制病情所需糖皮質激素用量分為實驗組(糖皮質激素量≤60 mg，n=129)與對照組(糖皮質激素量≥150 mg，n=58)，應用Taqman genotyping技術對研究對象進行位于GLCCI1基因的SNP rs37973基因分型，數據資料應用PLINK軟件進行logistic回歸分析。結果： 未發現GLCCI1基因的SNP rs37973與中國漢族種群大皰性皮膚病中糖皮質激素不敏感存在顯著相關性(P=0.7881,OR=1.062)。結論： GLCCI1變異體與中國漢族種群大皰性皮膚病糖皮質激素不敏感無顯著相關。

GLCCI1； 糖皮質激素； 大皰性皮膚病

自身免疫性大皰性皮膚病是一組以皮膚黏膜發生紅斑、 水皰、 大皰、糜爛為臨床特征的慢性復發性疾病，代表性的疾病有天皰瘡、大皰性類天皰瘡[1,2]。目前，糖皮質激素(GC，簡稱：激素)仍為治療大皰性皮膚病的一線用藥。多數患者經過激素治療能得到有效的長期緩解甚至治愈，但有一少部分患者通過增加激素用量或延長激素的使用療程仍未獲得滿意療效，導致大皰性皮膚病的病死率、費用增高，因此闡明激素不敏感的機制顯得尤為重要。2011年Tantisira等[3]通過全基因組關聯分析在哮喘患者中揭示了一種新的影響吸入性激素療效的遺傳藥理學決定子，發現功能性GLCCI1變異體(rs 37973)與哮喘病人對吸入性激素的反應大大降低相關。后有學者不斷在強直性脊柱炎、類風濕性關節炎、急性移植物抗宿主病等中發現GLCCI1變異體與激素不敏感顯著相關[4,5]。本實驗目的在于研究中國漢族種群自身免疫性大皰性皮膚病中激素不敏感與GLCCI1變異體是否存在相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 187例大皰性皮膚病患者(包括111例天皰瘡，76例大皰性類天皰瘡)均為我院門診及住院患者，均經山東省皮膚病性病防治研究所臨床+組織病理+免疫病理確診。其中敏感組患者129例(病情控制所需激素相當于潑尼松劑量≤60 mg)，男66例，女63例;非敏感組患者58例(病情控制所需激素劑量≥150 mg)，男33例，女25例。所有患者之間無任何血緣關系。患者按照以下方面進行疾病確診。

天皰瘡：(1)典型臨床表現：外觀正常皮膚或黏膜散發或簇集分布的大皰、水皰，皰壁多薄而松弛，Nikolsky(尼氏征)陽性；(2)組織病理示：棘層松解、表皮內裂隙和水皰；(3)直接免疫熒光：表皮細胞間可見IgG、C3的沉積，呈網狀分布；(4)間接免疫熒光：血清中查到IgG抗體。

大皰性類天皰瘡：(1)典型的臨床特征：好發于胸腹部和四肢近端，在外觀正常的皮膚或紅斑基礎上出現緊張性水皰或大皰，呈半球狀，皰壁較厚，不易破潰，破潰后糜爛面常覆以痂皮或血痂，Nikolsky(尼氏征)陰性；(2)組織病理示：表皮下水皰，真皮乳頭血管周圍有嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞浸潤；(3)直接免疫熒光：基底膜帶可見IgG、C3線狀沉積；(4)間接免疫熒光：血清中查到IgG抗體。

1.2 材料 經患者知情同意后，采集其上肢靜脈血液(至少5 mL)，將血樣用抗凝管盛裝，放入超低溫冰箱(-80℃)中存放。采用AXYGEN試劑盒提取基因組DNA，取適量DNA進行純度檢測并標化。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針設計 本實驗所用GLCCI1基因上的SNP rs37973引物及探針由美國ABI公司設計并合成(表1)。

1.3.2 Taqman PCR 將標準化制備成同一濃度后的DNA上機，按照絕對定量PCR文件的建立、進行重點讀板文件的建立、進行背景熒光讀取、進行絕對定量PCR、結果讀取分析、Taqmqn Genotyper software軟件分析等步驟，完成實時定量熒光PCR，進行數據分析。

1.3.3 實驗數據分析 將Taqman實時定量熒光PCR中得到的數據資料應用PLINK軟件進行logistic回歸分析。

2 結果

分別統計各組中SNP rs37973最小等位基因位點出現的頻率，比較各組中該等位基因位點有無統計學意義，數據分析結果，見表2。

表1 引物和探針序列

表2 SNP rs37973與實驗組、對照組間的關聯結果

3 討論

自身免疫性大皰性皮膚病是一組以皮膚黏膜發生紅斑、 水皰、 大皰、糜爛為臨床特征的慢性復發性疾病，臨床上最常見的為天皰瘡、大皰性類天皰瘡，糖皮質激素聯合免疫抑制劑治療常有效。大皰性皮膚病的診斷必須以三個獨立的診斷標準集合為基礎，分別是臨床特征、組織病理學檢查和免疫學檢查。

目前，糖皮質激素仍是自身免疫性大皰性皮膚病的第一線治療藥物，自其應用于臨床以來，天皰瘡[6]及大皰性類天皰瘡的死亡率大大降低。治療時應盡量遵循及時治療、足量控制、正確減量、最小劑量維持的原則。雖然多數患者經糖皮質激素治療能取得滿意療效，但有少數患者對大劑量糖皮質激素治療反應很差或無反應，即使加大用量也不能控制病情的進展，病人預后較差。

2011年Tantisira等[3]通過全基因組關聯分析在哮喘患者中揭示了一種新的影響吸入性糖皮質激素療效的遺傳藥理學決定子。首先以家庭篩查算法為基礎，從534290單核苷酸多態性(SNPs)中挑選有統計學效力小數目變異體進行分析，以確定吸入性糖皮質激素治療反應時的肺功能變化。結果在SNP rs37972發現了一種顯著、重復的相關性，此相關在4個獨立人群含935人中重復出現(P=0.0007)。SNP rs37972在基因圖譜中對應于糖皮質激素誘導的轉錄基因1(GLCCI1)，并與rs37973完全連鎖不平衡。SNP rs37972和rs37973均與GLCCI1的表達減少相關。總體接受治療受試者中，突變rs37973等位基因純合子者一秒用力呼氣量平均增加僅是接受相同治療野生型等位基因受試者的1/3[(3.2±1.6)%與(9.4±1.1%)]，且其不良風險明顯要高[OR=2.36，95%CI(1.27，4.41)]，基因型占總吸入性糖皮質激素反應變異性的6.6%。因此學者們得出結論功能性GLCCI1變異體與哮喘患者對吸入性糖皮質激素的反應明顯下降相關。

GLCCI1基因位于7號染色體上，包括8個外顯子，其廣泛分布于肺細胞與免疫細胞中，且當有外源性糖皮質激素存在時，其表達量會大大增加。GLCCI1是糖皮質激素誘導細胞凋亡的早期標志之一[7]，而細胞凋亡又是減輕淋巴細胞、嗜酸粒細胞浸潤的重要機制。若其表達減少可影響炎癥細胞的凋亡，從而進一步導致機體對糖皮質激素敏感性降低。

迄今為止，已有不少學者在其它自身免疫性疾病中也發現類似現象，如強直性脊柱炎、類風濕性關節炎、急性移植物抗宿主病等[4,5]。但本研究并未發現GLCCI1變異體與糖皮質激素不敏感存在顯著相關性。推測可能的原因是種族異質性差異及樣本量的不足。

綜上所述糖皮質激素不僅參與調控體內免疫與炎性反應過程，而且調控個體基本的生命過程，為體內最重要的糖皮質激素，其在臨床治療中的應用也備受關注。因此，臨床治療中所出現的個體激素敏感性的不同及糖皮質激素不敏感甚至抵抗現象的研究也隨之成為熱點。相信隨著人類基因組計劃的不斷完善，分子生物學技術的不斷進步，多元化的基因檢測技術誕生，不久的將來影響糖皮質激素敏感性的機制將最終被一一闡明。

[1] Hammers CM, Schmidt E, Zillikens D. Autoimmune blistering skin diseases: diagnostic and therapeutic approach[J]. Dtsch Med Wochenschr,2014,139(28-29):1473-1477.

[2] Kershenovich R, Hodak E, Mimouni D. Diagnosis and classification of pemphigus and bullous pemphigoid[J]. Autoimmun Rev,2014,13(4-5):477-481.

[3] Tantisira KG, Su JL, Harada M, et al. Genomewide association between GLCCI1 and response to glucocorticoid therapy in asthma[J]. N Engl J Med,2011,365:1173-1183.

[4] Szalai R, Matyas P, Varszegi D, et al. Admixture of beneficial and unfavourable variants of GLCCI1 and FCER2 in Roma samples can implicate different clinical response to corticosteroids[J]. Mol Biol Rep,2014,41:7665-7669.

[5] Meara AO, Boukouaci W, Robin M, et al. GLCCI1 and glucocorticoid receptor genetic diversity and response to glucocorticoid-based treatment of graft-versus-host disease[J]. Biol Blood Marrow Transplant,2015,21:1246-1250.

[6] Rosenberg FR, Sanders S, Nelson CT. Pemphigus. A 20-year review of 107 patients treated with corticosteroids[J]. Arch Dermatol,1976,112:962-970.

[7] Chapman MS, Qu N, Pascoe S, et al. Isolation of differentially expressed sequence tags from steroid-responsive cells using mRNA differential display[J]. Mol Cell Endocrinol,1995,108:R1-7.

(收稿：2016-04-12 修回：2016-08-27)

Lack of association between GLCCI1 variant and glucocorticoid sensitivity in Chinese patients with bullous diseases

DUTiantian1,2,FUXi'an1,SUNYonghu1,YUGongqi1,WANGZhenzhen1,YANGBaoqi1,LUXianmei1,LIUHong1,ZHANGFuren1.

l.ShandongProvincialInstituteofDermatologyandVenerueology,ProvincialAcademyofMedicalScience,Jinan250022,China; 2.SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China

ZHANGFuren,E-mail:zhangfuren@hotmail.com

Objective: To investigate the association between GLCCI1 gene and GC sensitivity in Chinese patients with bullous diseases. Methods: A total of 187 subjects were divided into GC-sensitive group (control dose ≤60 mg, n=129) and GC-insensitive group (control dose ≥150 mg, n=58). Single SNP (rs37973) was genotyped with TaqMan SNP Genotyping Assay Kit on the GeneAmp 7900 Sequence Detection System using specific TaqMan probes. The statistical analysis was performed using logistic regression in PLINK. Results: We failed to detect rs37973 variation in the patients with GC-insensitive bullous diseases (P=0.7881, odds ratio=1.062). Conclusion: There is no association between GLCCI1 and glucocorticoids sensitivity in Chinese patients with bullous diseases.

GLCCI1; glucocorticoids; bullous diseases

1山東省皮膚病性病防治研究所，濟南，250022 2濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，濟南，250062

張福仁，E-mail: zhangfuren@hotmail.com