主動外排機制和膜蛋白缺失在陰溝腸桿菌耐藥中的研究

扈會整，蘇庚詢，張曄婷，任偉娟，文 杏，任超杰，王 嬋

(陜西省核工業二一五醫院，陜西 西安712000)

主動外排機制和膜蛋白缺失在陰溝腸桿菌耐藥中的研究

扈會整，蘇庚詢，張曄婷，任偉娟，文 杏，任超杰，王 嬋

(陜西省核工業二一五醫院，陜西 西安712000)

陰溝腸桿菌是醫院感染的重要病原菌，由于頭孢菌素等廣譜抗菌藥物的廣泛使用，陰溝腸桿菌的耐藥水平不斷增加，此菌具有染色體介導的bush I(AmpC)[1]型β-內酰胺酶(又稱誘導酶或C類頭孢菌素酶)，常在治療過程中產生多重耐藥[2，3]，多重耐藥的陰溝腸桿菌引起的菌血癥有很高的病死率。給臨床治療和院內感染控制帶來了極大的挑戰[4]。陰溝腸桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機制，是否與細胞內存在主動外排機制和膜蛋白缺失有關，我們對此作了相應的試驗和基因分型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源與質控菌株 2012年6月至2013年5月從我院臨床各種感染患者的標本中共分離獲得不重復的100株陰溝腸桿菌，其中耐碳青霉烯酶的菌株20株。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922，ATCC13047。

1.1.2 試劑和設備 M-H培養基(杭州天和)；菌種及藥敏鑒定使用VITEK-2全自動細菌藥敏鑒定系統及配套試劑(購于法國生物梅里埃公司)；PCR擴增試劑購于上海生物工程有限公司；100 bp DNA梯帶標志物(大連寶生物)，Eppendorf centrifuge5417R低溫離心機，MJ Peltier Thermal Cycler(MJ Research)，Bio-Rad電泳儀，Bio-Rad凝膠成像系統，氰氯苯腙(CCCP)終濃度5 mg/L(Sigma)，IMP Etest試條(0.002-32tlg/m1)(瑞典AB Biodisk)，瓊脂糖(英國Oxoid公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCCP(氰氯苯腙)抑制作用 CCCP對主動外排泵表型特征的影響配制水解酪蛋白(M-H)瓊脂和含CCCP(終濃度5 mg/L，該濃度對外排泵有較好抑制作用，而對細菌生長無影響)的M—H瓊脂平皿，挑取2-3個過夜培養的菌落，用生理鹽水調至0．5麥氏單位，按照K-B法標準操作程序涂布菌懸液和貼Etest試條，放35℃培養24 h，觀察CCCP對IMP和MPM的MIC的逆轉作用。當存在CCCP時IMP和MPM的MIC值比缺乏時相應的MIC下降至原值的1/3，說明提示主動外排機制存在。

1.2.2 基因檢測方法 acrAB的循環條件：預變性94℃-5 min、變性94℃-30sec、退火58℃(54℃)-30sec、延伸72℃-40sec、再延伸72℃-10 min,共循環35周。純水為陰性對照。耐藥基因檢測試劑盒由上海生物工程公司提供。應用PCR方法，并用瓊脂糖凝膠電泳成像，在凝膠成像系統中觀察結果并采集圖像。引物序列見下表1。

表1 基因引物序列

1.2.3 外膜蛋白分析 收集200 ml過夜培養的菌液，超聲波破碎細菌3000轉4℃離心10 min去除未破碎的細菌，離心10000轉90 min收集沉淀物。用含十二烷基硫酸鈉緩沖液重新沉淀，室溫放置1 h，重復該兩步驟得到沉淀物備用。緩沖液與外膜蛋白混勻后煮沸10 min，在電泳儀上進行尿素十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后用考馬斯亮藍染色。

2 結果

2.1 CCCP存在與否對IMP體外抗茵活性的影響 20株亞胺培南和美羅培南耐藥的陰溝腸桿菌中，20均表現為外排泵表型試驗陽性，CCCP存在使IMP MIC下降至4個濃度梯度的菌株有15株，下降至3個濃度梯度的菌株有5株，CCCP存在使MPM MIC下降至4個濃度梯度的菌株有12株，其中有12株菌同時對兩種藥物有明顯的外排作用。

2.2 外排泵基因擴增檢測結果 18株同時檢測出acrA和acrB基因，目標片段為1 194 bp和800 bp,擴增產物電泳結果如圖1。

注：1.acrB 2.acrA 3.陰性對照 4.Marker(2 000 bp) DNA梯帶

2.3 外膜蛋白分析 外膜蛋白凝膠電泳分析如圖2，標準菌株ATCC13047有四種蛋白，37 kDa條帶為OmpA、38 kDa條帶為OmpF、41 kDa條帶為OmpC、47 kDa條帶為LamB，其中38 kDa和41 kDa的條帶與大腸埃希菌的OmpF和OmpC相對應，他們都是與耐藥有關的膜蛋白。所測20株陰溝腸桿菌中，有5株38 kDa條帶缺失，7株41 kDa條帶缺失，同時缺失的有3株。如圖2。

注：1.陰溝腸桿菌膜缺失標本 2.陰溝腸桿菌ATCC13047 3.蛋白質分子量標準

圖2 外膜蛋白凝膠電泳分析

3 討論

主動外排是一種特殊的能量依賴系統，能使進入體內的藥物蹦出體外，從而使體內的藥物濃度不足而導致耐藥。其中AcrAB-TolC[5]的外排系統在革蘭陰性菌多重耐藥過程中發揮著重要作用，能排出多種結構上不相同的化合物。其他的外排泵也可能有此功能，但是大多數是不表達的，Astrid Perez[6]等對這個系統進行了測序分析，發現acrA，acrB和acrR基因的序列和銅綠假單胞菌有很高的同源性，所以外排泵AcrAB-TolC這個系統在臨床分離菌株多重耐藥中起著重要的作用。S.Pournaras[7]等研究，外排泵表達在銅綠假單胞菌美羅培南和亞胺培南耐藥中的作用。CCCP為質子泵抑制劑的代表制劑，能破壞細菌跨胞漿膜的質子梯度，導致轉運蛋白失去能量供應而起作用。一般認為CCCP作用使陰溝腸桿菌對IMP的MIC下降至1/3，表明細菌可能存在泵出機制，我們研究的20株陰溝腸桿菌外排泵表型試驗陽性，此系統可以將已進入細菌胞質的抗菌藥物排出菌體外，使之治療失敗 。說明主動外排系統是我們研究本地區陰溝腸桿菌耐藥的主要機制。

細菌的膜蛋白及形成管道是細菌與外界進行交流的路徑，也是抗生素透過細菌細胞膜的重要通道，細菌膜蛋白的缺失可阻止抗生素進入細菌，從而引起細菌對抗生素的耐藥。研究發現與亞胺培南耐藥有關的為外膜孔蛋白(OprD2)，外膜蛋白孔道是小分子的亞胺培南選擇性快速進入菌體的特異性通道，也允許帶有陽性電子基團的各種糖類及堿性氨基酸非特異擴散。不僅能形成亞胺培南的特異結合位點，同時發現堿性氨基酸為亞胺培南的競爭性抑制劑。外膜通透性下降 ，外膜蛋白的改變或減少 ，使抗菌藥物進入細菌的通道減少或缺失，本研究20株耐碳青霉烯類藥物的陰溝腸桿菌有9株膜蛋白缺失，其中有5株38 kDa條帶缺失，7株41 kDa條帶缺失，同時缺失的有3株，oprD2 基因缺乏無，提示蛋白基因缺失不是本組耐藥的主要原因，但不排除因基因突變或基因表達下調導致陰溝腸桿菌對IMP耐藥。

總之，陰溝腸桿菌對常用抗菌藥物耐藥情況及對碳青霉烯類藥物的耐藥性機制復雜，主動外排機制存在是其重要的耐藥基理。膜孔蛋白基因缺失也與其有重要的關系。

[1]Jacoby GA.AmpC beta-lactamases[J].Clin Microbiol Rev,2009,22(1)：161.

[2]洪秀華.臨床微生物學檢驗[M].北京:中國醫藥科技出版社,2004.224.

[3]扈會整，劉 婧,劉漢芳.對多重耐藥黏質沙雷菌的抗菌藥物聯合應用模式的初步研究[M].臨床檢驗雜志，2012，5(30)390.

[4]Jean SS,Hsueh PR.High burden of antimicrobial resistance in Asia[J].Int J Antimicrob Agents,2011,37(4):291.

[5]Doi Y,Yokoyama K.Yamane K，et al．Plasmid-mediated 16S rRNA methylasein Serratia marcescens conferring high-level resistanceto aminog1ycosides[J]．Antimicrob Agents Chemother，2004，48(2)：491．

[6]Astrid perez,Delia Canle,Cristina Latasa,et al.Cloning,nucleotide sequencing,and analysis of the AcrAB-ToLC efflux pump of Enterobscter cloacae and determination of its involvement in antibiotic resistance in a clinical isolate[J].J Antimicrobial Chemotherapy,2007,51(9):3247.

[7]Poumaras S,Manaati M, Spanakis N,et al.Spread of efflux pump overexpressing,non-metallo-B-lactamase-producing,meropenem-resistant but ceftazidime suscepyible Pseudomonas aeruginosa in a region with blaVIM[J].J Antimicrobial Chemotherapy,2005,56:(4):761.

1007-4287(2016)12-2097-03

扈會整(1972-),女，副主任技師，檢驗科主任，研究方向:臨床微生物檢驗與分子診斷。

2016-03-12)