術前化療對骨肉瘤、滑膜肉瘤中Bcl-2、P-gp表達的影響

梁鉑堅，李宏偉，潘 峰，鞠海寧

(吉林大學中日聯誼醫院 骨科，吉林 長春130033)

術前化療對骨肉瘤、滑膜肉瘤中Bcl-2、P-gp表達的影響

梁鉑堅，李宏偉*，潘 峰，鞠海寧

(吉林大學中日聯誼醫院 骨科，吉林 長春130033)

骨肉瘤是惡性骨腫瘤中常見的一種，又稱為成骨肉瘤，源于間葉組織，可以產生骨樣組織的梭形基質細胞，好發于青少年，它約占骨原發惡性腫瘤的20%，易復發和轉移，預后差[1]。滑膜肉瘤是軟組織腫瘤的一種，主要發生于青壯年肢端深部的軟組織，其惡性度高，而且發病率呈逐年上升趨勢，是一種嚴重影響青壯年身心健康的惡性腫瘤[2]。近年來骨肉瘤和滑膜肉瘤仍以手術治療為主，放化療為輔的綜合治療手段，其在一定程度上提高了患者的生存率，很大程度上提高了患者的5年生存率[3]。但臨床上仍有一定比例患者的化療失敗都是由化療原發性或繼發性耐藥而導致。因而,如何使骨肉瘤及滑膜肉瘤的化療更具有針對性、有效性,對化療敏感性預測的研究顯得至關重要。

Bcl-2是細胞凋亡的抵制基因，是目前發現的與凋亡密切相關的原癌基因之一[4]。其在癌旁組織，癌前病變組織及腫瘤組織中高表達，而在正常組織中則不表達或低表達，由此提示，Bcl-2與腫瘤的發生發展密切相關。有研究表明Bcl-2基因表達的高低可以有效預測腫瘤細胞對化療的敏感性。并且現已有研究證實骨肉瘤的預后與Bcl-2 表達的高低密切相關，在惡性骨腫瘤復發后Bcl-2的表達明顯增高[5，6]。

P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)位于細胞膜上，是一種能量依賴性的結合轉運蛋白，有研究發現P-gp具有抑制凋亡的作用，該發現在分子水平上為腫瘤耐藥與凋亡耐受之間建立了有機的聯系。研究表明P-gp通過抑制caspase-3和caspase-8兩條途徑的裂解激活來抑制caspase依賴型的細胞凋亡[7]。化療是腫瘤綜合治療的重要手段,也是治療一些腫瘤的唯一方法,但由于化療藥物本身的藥物毒性,致使某些腫瘤病人在接受化療治療的同時而產生了嚴重的不良反應,給病人的生活質量造成了一定的影響。因此，探索一種既準確又簡便的評價方法來預測化療療效,從而指導臨床選擇適合的化療方案,提高化療的療效。本文以骨肉瘤、滑膜肉瘤為研究對象，通過檢測骨肉瘤及滑膜肉瘤術前化療和未做術前化療標本中Bcl-2、P-gp的表達，探討術前化療和未做術前化療骨肉瘤、滑膜肉瘤組織中Bcl-2、P-gp的表達及與預后的關系，為臨床的腫瘤治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病例選擇標準

所選病例符合以下標準:①在吉林大學中日聯宜醫院骨病外科經穿刺活檢，病理組織學證實為骨肉瘤及滑膜肉瘤；②治療前經胸片、CT掃描排除遠處轉移；③在外院未行切開活檢、放療及其他治療；④術前均按MMIA方案化療。該方案由甲氨蝶吟(MTX)、異環磷酰胺(IFO)、阿霉素(DOX)組成。

按上述標準選吉林大學中日聯誼醫院2009-2012年診斷為骨肉瘤的10例患者、滑膜肉瘤7例患者。骨肉瘤的10例患者年齡13-18歲。發病部位：股骨下端6例、脛骨上端4例、滑膜肉瘤7例患者年齡18-50歲。發病部位：股骨下端3例、前臂1例、肩關節腋下3例。治療方式：術前化療二療程，休息二周后手術，術后繼續化療二療程(未作術前化療患者，術后直接進行化療二療程)，術中提取標本10%中性甲醛固定。隨訪結果：骨肉瘤10例患者中全部獲得隨訪。隨訪期內4例作術前化療患者未見轉移及復發。6例未作術前化療患者4例發生肺轉移，2例發生復發。滑膜肉瘤7例患者5例獲得隨訪，隨訪期內1例作術前化療患者未見轉移及復發，3例未作術前化療患者發生轉移及復發，1例死亡。

1.2 主要試劑

一抗為鼠抗人單克隆抗體Bcl-2及P-gp。顯色用該公司生產的即用型第二代Elivision TMplus廣譜試劑盒。

“是慢成說的。”大梁也扭頭瞄著我，“慢成說很有可能。他說什么，橘生淮南就是橘，挪到淮北就不是橘了。東洋人帶了十幾年，很可能講的東洋話。”

1.3 實驗方法

嚴格按照北京中杉金橋生物技術有限公司生產的免疫組化試劑盒進行操作。

1.4 結果判定

Bcl-2染色陽性以細胞漿內出現黃色或棕黃色顆粒為標準，P-gp染色陽性以細胞膜出現棕褐色細顆粒為標準。每張切片隨選取5個高倍視野，以陽性細胞數目所占比例進行分級：<5%為陰性(-)，5%-25%為低度表達(+)，25%-50%為中度表達(++)，>50%為高度表達(+++)。低度表達以下視為陰性，中低度表達及中度表達以上表達視為陽性有意義。

1.5 統計學方法

本實驗數據均采用均數±標準差表示。采用SPSS 11.0統計軟件包處理，組間比較用方差分析。

2 結果

2.1 術前化療與未作術前化療骨肉瘤患者組織中Bcl-2與P-gp的表達

術前化療骨肉瘤患者組織P-gp的陽性表達與未做術前化療骨肉瘤患者組織中相比較，術前化療骨肉瘤患者的P-gp的陽性表達明顯低于未做術前化療骨肉瘤患者，其陽性表達率分別為12.75%、45.2%(P<0.05),見表1。

2.2 術前化療與未作術前化療骨肉瘤患者組織中Bcl-2與P-gp表達的相關性

術前化療和未做術前化療的骨肉瘤患者組織中Bcl-2、Pg-p的表達均具有相關性。隨著Bcl-2表達率的升高Pg-p表達也呈現顯著增高趨勢。

2.3 術前化療與未作術前化療滑膜肉瘤患者組織中Bcl-2與P-gp的表達

術前化療滑膜肉瘤患者組織Bcl-2的陽性表達與未做術前化療滑膜肉瘤患者組織中相比較，術前化療滑膜肉瘤患者的Bcl-2的陽性表達明顯低于未做術前化療滑膜肉瘤患者，其陽性表達率分別為16%、67% (P<0.05),見表1。

術前化療滑膜肉瘤患者組織Pg-p的陽性表達與未做術前化療滑膜肉瘤患者組織中相比較，術前化療滑膜肉瘤患者的Pg-p的陽性表達明顯低于未做術前化療滑膜肉瘤患者，其陽性表達率分別為17.7%、58.2% (P<0.05),見表1。

2.4 術前化療與未作術前化療滑膜肉瘤患者組織中Bcl-2與P-gp的表達的相關性

術前化療和未做術前化療的滑膜肉瘤患者組織中Bcl-2、P-gp的表達均具有相關性。隨著Bcl-2表達率的升高P-gp表達也呈現顯著增高趨勢。

表1 術前化療與術前未化療患者腫瘤組織中Bcl-2與P-gp的表達

注：表達率為陽性細胞數所占比例；*P<0.05

3 討論

骨肉瘤是一種好發于青壯年的惡性骨腫瘤，其原發于骨髓腔，由腫瘤性成骨細胞、骨樣組織所組成，是以瘤細胞能直接形成骨樣組織或骨質為特征，起源于成骨性間葉組織的最常見的原發性惡性骨腫瘤，發病突然，主要發病部位在下肢。顯微鏡下可見許多瘤細胞，細胞及細胞核大小，形狀不一，有小型多核巨細胞，梭形細胞，不成熟的軟骨細胞及惡性成骨細胞，細胞核大，染色很深。可于數月內出現肺部轉移，存活率低。其惡性度高且發病率逐年上升[8-12]。

滑膜肉瘤是惡性程度較高的軟組織惡性腫瘤，源于關節、滑膜及腱鞘滑膜組織，是繼惡性纖維組織細胞瘤，脂肪肉瘤和橫紋肌肉瘤之后的第四種最常見的肉瘤類型。發病部位以四肢的大關節為多，也可好發于前臂、大腿，腰背部的肌膜和筋膜上。是發病率較高的一種軟組織肉瘤，一般原發于關節囊外，后穿入關節囊。滑膜肉瘤的發病機制目前還不清楚。主要臨床癥狀以局部腫脹、腫塊、疼痛，活動受限為主，X線以軟組織腫塊、腫塊鈣化、骨骼改變及骨膜反應為主要表現。病理分型為雙相型和單相型。滑膜肉瘤即可向區域淋巴結轉移。也可向遠隔肺部轉移[13，14]。

近年來骨肉瘤和滑膜肉瘤仍以手術治療為主、放化療為輔的綜合治療手段，其在一定程度上提高了患者的的5年生存率。但由于化療藥本身的藥物毒性,致使某些腫瘤病人在接受化療治療的同時而產生了嚴重的不良反應。因而探索一種既準確又簡便的評價方法來預測化療療效,以指導臨床選擇化療藥物和化療方案,提高化療療效。近年來研究證明，腫瘤的發生和演進不僅取決于腫瘤細胞增殖和分化程度，凋亡規律失常也與腫瘤發病密切相關，進而提出一種癌基因作用的新模式，即通過抑制細胞凋亡導致腫瘤生長。腫瘤分子生物學的研究揭示細胞增殖和細胞凋亡失控是腫瘤發生發展的重要機制。目前研究也發現，細胞凋亡機制在腫瘤中的發生、發展過程中可能有重要的地位，因此，細胞凋亡抑制基因已成為分子腫瘤學研究的一個熱點。

3.1 術前化療對骨肉瘤及滑膜肉瘤患者組織中Bcl-2表達的影響

腫瘤的發生和發展不僅取決于腫瘤細胞增殖和分化程度，凋亡規律失常也與腫瘤的發病密切相關。細胞凋亡也是當今腫瘤研究的熱點，其過程受到凋亡基因和抗凋亡基因的共同調節[15]。Bcl-2是細胞凋亡調控基因之一，在控制細胞凋亡的過程中Bcl-2參與抑制細胞凋亡的作用，它通過各種刺激因素廣泛抑制并誘導腫瘤細胞的凋亡、從而延長腫瘤細胞的活力[16]。Bcl-2基因通過編碼Bcl-2蛋白發揮抗凋亡作用，其機制為：(1)通過抗氧化劑作用或抑制氧自由基的產生而抑制細胞凋亡，而氧自由基產生分別分布在細胞的線粒體、內質網及核膜的位置，因此通過表達部位來提示腫瘤細胞的凋亡是通過抑制其調節抗氧化的途徑；(2)抑制凋亡發生是通過調節細胞內Ca2+水平的分布，在細胞凋亡時，Ca2+依賴性核酸內切酶的參與DNA的消化，而Bcl-2阻斷Ca2+從內質網釋出，降低了依賴于Ca2+核酸內切酶的活性，從而阻斷腫瘤細胞凋亡；(3)Bcl-2與Bax蛋自結合形成雜二聚體，來抑制Bax的促凋亡作用；(4)Bcl-2與ras相關蛋白交聯，使ras活化，其抑制凋亡的途徑是通過影響細胞的信號傳導；(5)Bcl-2蛋白通過阻斷內源性核酸內切酶的DNA切割活性從而阻斷細胞凋亡[17-19]。vaux等[22]研究發現，把Bcl-2基因轉入骨髓原始細胞使Bcl-2蛋白在細胞內高表達，導致腫瘤的發生，細胞的生存期延長，但未見明顯細胞增殖率增加。由此可見，Bcl-2主要是通過調控細胞凋亡來調節細胞死亡的。Yang Q[8]等研究表明，惡性腫瘤中Bcl- 2的高表達是導致腫瘤患者的預后不良的重要原因之一，并用實驗證明了Bcl- 2表達的高低與腫瘤患者預后的關系，其在骨肉瘤中的高表達是腫瘤惡性程度高的重要因素之一，并提出Bcl-2是預測化療療效的有效指標。

本實驗結果顯示：術前化療及未做術前化療骨肉瘤組織中Bcl-2的陽性表達率分別為10.9%和36.4%，術前化療及未做術前化療滑膜肉瘤組織中Bcl-2的陽性表達率分別為16%和67%，術前化療骨肉瘤及滑膜肉瘤患者組織中Bcl-2的表達明顯低于未做術前化療患者的表達。說明術前化療是藥物通過抑制Bcl-2的表達來有效降低的腫瘤的惡性程度。通過對所有患者進行隨訪，證實術前化療導致Bcl-2表達降低與預后有相關性，Bcl-2陽性表達率低的患者預后好。說明化療后骨肉瘤及滑膜肉瘤細胞中Bcl-2的陽性表達水平是預測化療療效的有用指標。

3.2 術前化療對骨肉瘤及滑膜肉瘤患者組織中P-gp表達的影響

骨肉瘤及滑膜肉瘤化療失敗的主要原因和多藥耐藥有著一定的關聯，多藥耐藥是指一種藥物作用于腫瘤細胞使之產生耐藥性后，該腫瘤細胞逐漸對未接觸過的、結構無關、作用靶點和機制不同的多種抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性。它是一種獨特的廣譜耐藥現象[20]。P-gp可以與親脂類化療藥物結合，依賴ATP跨膜轉運作用將藥物轉運到細胞外，使細胞內藥物濃度下降，形成P-gp介導的MDR[21]。P糖蛋白(P-gp) 是多藥耐藥基因(MDR)編碼的蛋白質，是ATP依賴型的藥物外排轉運體，位于細胞膜，由1280個氨基酸組成，分子量為170×103。P-gp是一種跨膜轉運糖蛋白，屬于ABC膜轉運蛋白超家族成員,是逆轉多藥耐藥(MDR)的主要靶點，在多種惡性腫瘤中均呈較高表達狀態[22]。有研究發現P-gp具有凋亡抑制作用，該發現在分子水平上為腫瘤耐藥與凋亡耐受之間建立了有機的聯系。研究表明P-gp通過抑制caspase-3和caspase-8兩條途徑的裂解激活來抑制caspase依賴型的細胞凋亡[2]。盡管目前有關骨肉瘤細胞及滑膜肉瘤細胞中MDR基因Pg-p表達研究尚少，但現已有研究結果提示P-gp在骨肉瘤及滑膜肉瘤中表現出內在性的高表達。在體外細胞株中已經成功建立了P-gp過度表達和多藥耐藥的因果關系。雖然P-gp在體內不同腫瘤中的表達和預后的相關性還有待于進一步研究，但多數學者認為骨肉瘤及滑膜肉瘤臨床預后不良與P-gp的表達相關[23，24]。

本研究應用免疫組化和對比分析的方法，術前化療及未做術前化療骨肉瘤及滑膜肉瘤組織中P-gp的表達進行了研究，結果顯示：術前化療及未做術前化療骨肉瘤組織中P-gp的陽性表達率分別為12.75%和45.2%，術前化療及未做術前化療滑膜肉瘤組織中P-gp的陽性表達率分別為17.7%和58.2%，術前化療骨肉瘤及滑膜肉瘤患者組織中P-gp的表達明顯低于未做術前化療患者的表達。有研究發現P-gp通過多藥耐藥途徑來抑制腫瘤細胞的凋亡，而本實驗結果顯示術前化療明顯降低了P-gp的表達，說明術前化療是藥物通過抑制P-gp的表達，降低了腫瘤多藥耐藥的發生，從而有效降低的腫瘤的惡性程度。術后對所有患者進行隨訪，證實術前化療導致P-gp表達降低與預后有相關性，P-gp陽性表達率低的患者預后好。說明化療后骨肉瘤及滑膜肉瘤細胞中P-gp的陽性表達水平是預測化療療效的有用指標。

綜上所述，本文得出如下結論:術前化療可以有效降低腫瘤的惡性程度。通過本實驗可以說明：術前化療導致Bcl-2、P-gp表達的降低與腫瘤的預后有相關性，進行術前化療的患者Bcl-2、P-gp陽性表達率低，其預后好。而同一患者Bcl-2、P-gp表達具有相關性，說明化療后骨肉瘤及滑膜肉瘤中Bcl-2、P-gp的陽性表達水平是預測化療療效的有用指標。

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吉林省科技發展計劃項目(200705307)

1007-4287(2016)12-2102-04

2016-02-27)

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