高鹽飲食增強內皮細胞TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用

孫春原，謝茗旭，劉愈穎，蔡燕飛，張 鵬，金 堅，馬 鑫

(江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122)

高鹽飲食增強內皮細胞TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用

孫春原，謝茗旭，劉愈穎，蔡燕飛，張 鵬，金 堅，馬 鑫

(江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122)

目的 探究內皮細胞中香草素受體4型瞬時感受器電位通道(TRPV4通道)與胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)在空間上的偶聯作用。方法 通過設定梯度鹽(培養基中外源加入20、40、80、160 mol·L-1NaCl)確定高鹽處理內皮細胞的最適鹽濃度；在細胞水平上，通過免疫熒光能量共振轉移(immuno-FRET)技術檢測人微血管內皮細胞(HMEC)和小鼠胸主動脈原代內皮細胞中TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用；在動物組織水平，通過同樣的技術檢測正常小鼠與高鹽誘導的高血壓小鼠的胸主動脈血管環上的內皮細胞中TRPV4與cPLA2的空間偶聯情況。結果 高鹽誘導內皮細胞的最適鹽濃度為40 mol·L-1NaCl；在細胞水平和動物組織水平上，高鹽處理的HMEC、小鼠胸主動脈原代內皮細胞和高鹽誘導的高血壓小鼠胸主動脈血管環上的內皮細胞中，TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用均明顯增強。結論 在細胞和組織水平上，高鹽飲食能增強內皮細胞中TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用，這種空間偶聯可能進一步引起兩者的功能偶聯，為血管內皮功能紊亂的研究提供了新的思路。

TRPV4；cPLA2；高鹽；胸主動脈；免疫熒光能量共振轉移；空間偶聯

香草素受體4型瞬時感受器電位通道(transient receptor potential vanilloid 4 channel，TRPV4通道)屬于非選擇型陽離子通道，對Ca2+具有中等通透性，激活TRPV4受體導致細胞內鈣離子濃度增高，進而調節各種生理或病理過程[1-3]。高鹽飲食是誘發許多心血管疾病中的關鍵因素，如高血壓等。Gao等[ 4]通過喂食♂ Wistar大鼠高鹽飼料發現，當高鹽飲食導致血壓上升幅度較大時，內皮細胞中TRPV4介導的血管舒張功能減弱，甚至被完全抑制。上述文獻表明TRPV4在高鹽飲食誘發的內皮功能紊亂過程中起著重要作用。

胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)是磷脂酶A2(PLA2)超家族的主要成員之一，在細胞內通過受體介導的Ca2+信號轉導，經磷酸化被激活，選擇性識別細胞膜甘油磷脂的sn-2位脂肪酸水解并釋放花生四烯酸(arachidonic acid ,AA)，AA在體內主要經過3種代謝途徑的代謝物均是血管中調節血管張力或炎癥的活性分子[ 5-7]；上述文獻表明cPLA2在調節血管張力過程中起著重要作用。

TRPV4和cPLA2在調節血管張力的過程中都起著重要作用，然而兩者之間的關系還是未知的，在此我們推測TRPV4與cPLA2通過近距離的物理偶聯實現信號轉導。因此，我們在細胞和動物組織水平上對TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用進行了研究，發現高鹽飲食能夠增強兩者間的空間偶聯作用。TRPV4與cPLA2空間上的靠近，可能會導致兩者之間功能上的相互作用，進而共同調節血管內皮功能紊亂。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及高鹽模型構建 健康的野生型C57小鼠40只，體質量20～25 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。動物飼養在SPF級動物房，環境濕度保持在50%，溫度維持在25 ℃左右，自由進食飲水，通過燈光控制系統使其生活在每天50%光照時間，50%黑夜時間交替中。將40只小鼠隨機均分成兩組，對照組喂食正常飼料，高鹽組喂食含有8% NaCl的高鹽飼料；分組前3 d開始通過尾套法監測小鼠血壓，連續觀察并記錄16 d，并統計數據。

1.2 主要試劑及儀器 ECM(1001)培養基購于美國ScienCell公司；Paraformaldehyde(PFA)(16005)，Collagenase (Clostridium histolyticum)(C9891)購于Sigma公司；山羊源TRPV4抗體(SC-4752)，兔源cPLA2抗體(SC-1724)購于美國Santa Cruz公司； CD31抗體(ab9498) 購于美國Abcam公司； Donkey anti-Rabbit 熒光二抗(波長488，1723019)和Donkey anti-Goat 熒光二抗(波長546，1714714)，LipofectamineTM 2000(11668-027)，Opti-MEM(31985-070)購自美國Invitrogen公司；cPLA2-GFP質粒購于上海和元生物有限公司；OCT冷凍切片包埋劑Tissue-Tek(4583)購于美國SAKURA公司。

1.3 高鹽梯度處理細胞 HMEC細胞復蘇在ECM培養基中，生長2～3 d后，消化傳代，并將細胞鋪在激光共聚焦小皿中，2 h細胞貼壁，分別加入20、40、80、160 mol·L-1的NaCl，并培養3 d。

1.4 原代細胞分離及培養 頸椎脫臼法處死小鼠并固定，打開小鼠胸腔，沿小鼠脊椎用剪刀急性分離胸主動脈，置于4 ℃ PBS中，移至超凈工作臺中，PBS清洗3～5次；去除血管周圍組織，將分離出胸主動脈血管組織剪成4 mm左右的碎塊，PBS清洗以除去血球和脂肪組織，將洗凈的組織置于50 mL離心管中；加入0.02%膠原酶(ECM基礎培養基配置)，搖勻，至于37 ℃的水浴鍋中消化45～60 min；待消化完成后，加入ECM完全培養基終止消化，吹打懸浮；將組織懸液吸入10 mL離心管中，3 000×g離心5 min；棄去上清，加入1 mL ECM完全培養基重懸，懸浮液轉移至細胞培養瓶中，補加適當ECM完全培養基至5 mL，置于37 ℃，5% CO2及飽和濕度條件的培養箱中培養。

1.5 細胞轉染 將處于對數期的HMEC細胞用0.25%胰酶消化后，按每孔1.0×105個鋪于激光共聚焦小皿中；取2 μL lipofectamineTM 2000以及1 μg質粒分別與50 μL MEM混合，室溫孵育5 min；將上述兩種混合液混合，室溫下孵育25 min；將混合液充分混勻后加入激光共聚焦培養皿中；4～6 h后更換培養基。

1.6 細胞免疫熒光染色 在共聚焦培養皿中鋪入適量的原代胸主動脈血管內皮細胞，待細胞生長匯合度到70%～80%后，PBS清洗3次，洗去漂浮的死細胞；加入200 μL 4% PFA，室溫固定30 min；PBS清洗干凈，然后在共聚焦培養皿中加入200 μL 0.2% Triton X-100，室溫通透10 min；PBS清洗干凈，加入200 μL 5% BSA，37 ℃封閉1 h；用PBS清洗干凈，在共聚焦培養皿中添加200 μL一抗(TRPV4抗體和cPLA2抗體混合稀釋液)，4 ℃孵育過夜；PBS清洗干凈，在共聚焦培養皿中加入200 μL二抗( Donkey anti-Rabbit 熒光二抗和Donkey anti-Goat 熒光二抗混合稀釋液)，37 ℃避光孵育2 h；PBS清洗干凈，在共聚焦培養皿中加入200 μL PBS，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 組織冰凍切面的制作 取顯微鏡下分離干凈的小鼠胸主動脈血管，PBS清洗干凈，洗去血管中的殘留血液；4%多聚甲醛固定過夜；依次用20%及30%蔗糖溶液進行脫水；取出固定血管，置于OCT膠浸潤1 h而后放置在-80 ℃ 冷凍過夜；將冷凍好的血管組織塊放置在組織支撐架上，取出將其夾緊在與切片機持承器上，啟動粗進退鍵，旋轉旋鈕，將組織修平；調好10 μm厚度、防卷板；切片時，速度保持勻速，切片可以均勻的通過刀防卷板間的通道，在持刀器的鐵板與防卷板之間，將防卷板輕輕掀起，取1片載玻片，正面向下將其粘附在載玻片上，做好標記，置于-30 ℃冰箱中保存。

1.8 免疫組化 將切好的冰凍切片放置在PBS緩沖液中浸泡5 min，去除組織上的OCT膠；用免疫組化筆圈出組織位置；將切片放置在濕盒中，在組織上加入適量的10% BSA，37 ℃封閉1 h；PBS清洗干凈，在組織上加入適量稀釋好的一抗，4℃濕盒中孵育過夜；PBS清洗干凈；在組織上加入適量稀釋好的二抗，37 ℃濕盒中閉光孵育2 h；PBS清洗干凈；在組織上加入適量30%的甘油，蓋上蓋玻片封片；指甲油封邊；共聚焦顯微鏡觀察。

2 結果

2.1 高鹽環境對內皮細胞系中TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用的影響 梯度高鹽處理HMEC結果顯示：20 mol·L-1NaCl處理HMEC細胞3 d后，細胞中的TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用沒有差異；而40、80 mol·L-1NaCl處理后，細胞中的TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用明顯提高，40、80 mol·L-1NaCl處理后，TRPV4與cPLA2的FRET效率分別增加了57.8%(P<0.05，n=20)，56.5%(P<0.05，n=20)，且差異有統計學意義(Fig 1)；80 mol·L-1NaCl處理后，細胞死亡率很高，細胞形態變化明顯；160 mol·L-1NaCl處理后，細胞基本死亡。故在不影響細胞生長狀態的情況下，40 mmol·L-1NaCl能明顯增強TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用。

Fig 1 Effect of high salt on physical coupling of TRPV4 and cPLA2 in HMEC

*P<0.05vsControl.(Scale bar，10 μm)

2.2 外源性增加cPLA2對TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用的影響 將cPLA2-GFP質粒轉染HMEC細胞，并用免疫熒光共振能量轉移(FRET)方法檢測，結果顯示：cPLA2-GFP導入HMEC細胞，對細胞中的TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用基本沒有影響；而40 mol·L-1NaCl處理后的cPLA2-GFP組細胞，其TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用，其FRET效率較cPLA2-GFP組細胞增加了38.2%(P<0.05，n=20)，差異具有統計學意義(Fig 2)。該結果表明，在細胞水平上，外源性增加cPLA2的表達對TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用無明顯影響，而高鹽誘導內皮細胞能明顯提高兩者的空間偶聯作用。

2.3 高鹽誘導的高血壓小鼠中胸主動脈原代內皮 細胞中TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用 尾套法測量小鼠血壓結果表明：在d 4，高鹽組小鼠給予8% NaCl高鹽飼料，喂養7 d后，根據統計結果顯示高鹽組小鼠MAP基本穩定，△MAP為(12.4±0.2) kPa(n=20，Fig 3A)。

Fig 2 Effect of cPLA2 on physical coupling of TRPV4 and cPLA2 in HMEC

*P<0.05vscPLA2-GFP(Scale bar，10 μm)

原代分離小鼠胸主動脈內皮細胞后，其FRET結果顯示：High-salt組小鼠胸主動脈原代細胞的TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用較野生型小鼠有明顯提高，其FRET效率增加了59.3%(P<0.05，n/N=20/10)，差異具有統計學意義(Fig 3B)。表明在動物組織水平上，高血壓狀態下內皮細胞中的TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用增強。

2.4 高鹽誘導的高血壓小鼠胸主動脈血管環中TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用 對小鼠胸主動脈環冰凍切片，按照步驟進行免疫組化實驗，然后在激光共聚焦掃描顯微鏡下檢測其FRET效率，結果顯示：內皮細胞標記物CD31在血管環的內側一層表達；高鹽誘導的高血壓小鼠的胸主動脈環上的內 皮細胞中TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用較野生型小鼠有明顯增強，FRET效率增加了45.9%(P<0.05，n/N=20/10)，見Fig 4。表明在動物組織水平上，高血壓狀態下內皮細胞中的TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用增強。

Fig 3 The physical interaction of TRPV4 and cPLA2 in primary cultured endothelial cells in mice on a high-salt diet (8% NaCl)

*P<0.05vsControl(Scale bar，10 μm)

3 討論

研究表明[4]，高鹽飲食誘發的心血管疾病(如高血壓)中TRPV4與血管張力的調節密切相關；在高血壓大鼠主動脈內皮細胞中，Ca2+激活cPLA2，經過一系列信號轉導釋放內皮依賴性收縮因子(EDCF)，從而導致血管的收縮[ 8]。兩者均參與了血管張力的調節，然而兩者之間的相互作用不明，因此本文研究了兩者之間的空間偶聯作用。近期有文獻報道了TRPV4通道與其它蛋白之間產生相互作用共同調節各種生理或病理過程[ 9]，TRPV4通道與瞬時感受器電位通道C型成員1(TRPC1)相互形成異聚體離子通道，兩者不僅空間上形成通道聚合體，并且功能上發生相互作用，在血流剪切力的作用下共同調節血管的舒張作用[ 10]，并且TRPV4通道與大電導鈣激活鉀選擇性通道(KCa1.1)[ 11]及重要蛋白的小窩豐富的區域產生相互作用[ 12]。本研究結果表明高鹽飲食可以增強TRPV4通道與cPLA2蛋白的空間偶聯作用，結果與上述文獻報道相似，為研究調節血管內皮功能紊亂提供了新思路。

Zhang等[ 13]報道了高鹽飲食是誘發許多心血管疾病中關鍵性因素，并通過鹽濃度梯度處理內皮細胞，在細胞水平模擬病理狀態。因此本研究通過設定鹽濃度梯度(培養基中外源加入20、40、80、160 mol·L-1NaCl)處理人微血管內皮細胞(HMEC)確定不影響細胞正常生長狀態的最適誘導濃度為40 mol·L-1。Adebiyi等[ 14]通過immuno-FRET的方法證明了內源性的IP3R1與TRPC3在空間上發生 相互偶聯作用，但是并沒有和TRPC6或TRPM4在空間上發生偶聯作用。因此本研究在細胞水平上，通過immuno-FRET方法檢測人微血管內皮細胞中TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用，較充分地論證了高鹽誘導的內皮細胞系病理狀態下，內皮細胞中TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用明顯增強。然后在高鹽飲食的動物模型水平上，通過原代培養胸主動脈內皮細胞和胸主動脈組織段水平上，通過immuno-FRET技術證明了高鹽飲食的動物模型中，內皮細胞中TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用明顯增強，此結果與高鹽誘導的HMEC細胞系結果一致。Ma等[ 15]報道的在糖尿病大鼠體內，不僅內皮細胞中TRPV4與KCa2.3空間偶聯作用發生了改變，而且兩者之間的功能偶聯同樣發生了改變，TRPV4-KCa2.3信號傳導途徑在乙酰膽堿誘導的平滑肌細胞超極化和大鼠腸系膜微動脈血管的松弛中起著關鍵性作用。本研究結果表明，高鹽飲食增強內皮細胞中TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用，而通過上述文獻我們可以合理推斷TRPV4與cPLA2可能在功能上共同調節了高鹽飲食誘導的內皮細胞功能紊亂，下一步我們可以通過小鼠血管張力實驗進行驗證兩者功能上的相互作用。

Fig 4 The physical interaction of TRPV4 and cPLA2 in arterial segments in mice on a high-salt diet (8% NaCl).

*P<0.05vsControl(Scale bar，10 μm)

綜上所述，本研究通過探究高鹽飲食對內皮細胞中TRPV4與cPLA2空間偶聯作用的影響，發現高鹽飲食增強了內皮細胞中TRPV4與cPLA2的空間偶聯作用，這可能揭示著兩者在功能上也相互作用，共同調節血管張力，但其機制尚待進一步研究探討，此研究為血管內皮功能紊亂提供了新的方向。

(致謝:本文實驗在江南大學藥學院藥物設計及分子藥理學實驗室完成，感謝我的導師金堅教授，感謝馬鑫教授。感謝所有實驗參與人員的大力幫助！)

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High salt diet enhances the physical coupling between TRPV4 and cPLA2

SUN Chun-yuan,XIE Ming-xu,LIU Yu-ying,CAI Yan-fei,ZHANG Peng，JIN Jian，MA Xin

(SchoolofPharmaceuticalSciences，JiangnanUniversity，WuxiJiangsu214122，China)

Aim To observe the physical coupling between transient receptor potential channel vanilloid type 4 (TRPV4) and cPLA2 in endothelial cells. Methods We investigated the physical association of TRPV4-cPLA2 coupling by immunofluorescence resonance energy transfer (immuno-FRET) to assess the spatial proximity between TRPV4 and cPLA2 in human microvascular endothelial cells (HMEC), primary cultured endothelial cells and in thoracic aortas rings from high salt-induced hypertension mice. Results At the cellular level，with high salt treatment, the physical interaction of TRPV4 and cPLA2 was significantly enhanced in primary vascular endothelial cells and HMEC. Furthermore, in thoracic aortas rings from high salt-induced hypertension mice, we found an increases interaction between TRPV4 and cPLA2 in endothelial cells from arterial segments . Conclusion High-salt treatment increases the endothelial TRPV4-cPLA2 coupling, indicating that this coupling may provide a new target for vascular endothelial dysfunction.

TRPV4;cPLA2;high salt; thoracic aorta; immune-fluorescence resonance energy transfer; spatial proximity

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.032.html

2016-07-21，

2016-09-08

國家自然科學基金資助項目(No 91439131)

孫春原(1991-)，男，碩士生，研究方向：藥理學，E-mail：15261593122@163.com； 馬 鑫(1981-)，男，博士，教授，研究方向：藥理學，通訊作者，E-mail：maxin@jiangnan.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.016

A

1001-1978(2016)12-1718-06

R-332；R322.121；R348.1；R329.25；R331.32；R345.61；R544.1