注射用核糖核酸Ⅱ上調p53誘導人白血病細胞凋亡

郭 珮,冉建華,李 靜,陳地龍,楊寶學,何 菲,熊 偉,石雪萍,李海星

(重慶醫科大學1.基礎醫學院組織細胞工程與干細胞研究室；2.基礎醫學院解剖學教研室；3.神經科學研究中心,重慶 400016； 4.北京大學醫學部基礎醫學院藥理學系,北京 100191)

注射用核糖核酸Ⅱ上調p53誘導人白血病細胞凋亡

郭 珮1,2,冉建華2,3,李 靜1,陳地龍1,楊寶學4,何 菲2,3,熊 偉1,石雪萍1,李海星1

(重慶醫科大學1.基礎醫學院組織細胞工程與干細胞研究室；2.基礎醫學院解剖學教研室；3.神經科學研究中心,重慶 400016； 4.北京大學醫學部基礎醫學院藥理學系,北京 100191)

目的 研究注射用核糖核酸Ⅱ誘導人白血病細胞系K562和KG1a細胞凋亡的作用。方法 以K562和KG1a細胞為研究對象，采用CCK-8法檢測注射用核糖核酸Ⅱ對細胞增殖的影響；流式細胞術檢測細胞凋亡率的變化；Hoechst 33258染色觀察細胞核形態；免疫印跡技術檢測p53及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的表達。結果 以100～300 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ處理K562和KG1a細胞12、24、48 h后，CCK-8檢測結果顯示K562和KG1a細胞的增殖降低，抑制率明顯增高，并呈時間劑量依賴性；100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ處理K562和KG1a細胞24 h后，FCM結果顯示細胞凋亡率隨藥物劑量增加而增高；Hoechst 33258染色觀察到細胞核出現染色質濃縮聚集、染色加深等凋亡指征；Western blot結果顯示，注射用核糖核酸Ⅱ上調p53、Bax和cleaved caspase-3的表達，下調Bcl-2表達。結論 注射用核糖核酸Ⅱ通過上調p53，調控Bcl-2/Bax的表達，激活caspase-3誘導人白血病K562和KG1a細胞凋亡。

注射用核糖核酸Ⅱ;白血病;p53;K562細胞；KG1a細胞; 凋亡

白血病是以惡性克隆性白血病細胞增殖異常、分化障礙、凋亡受阻和正常造血受抑制為特點的造血系統惡性疾病，其發病機制非常復雜，與染色體斷裂、易位所引起的癌基因激活、抑癌基因失活等多種因素有關[1]。臨床上，白血病的分型復雜，發病機制尚未完全闡明。目前的治療手段以化療為主而療效欠佳，需要尋找新的治療藥物。

注射用核糖核酸Ⅱ(商品名BP素)是從牛胰腺提取的高純度、具有生物活性的核糖核酸，有抗腫瘤和提高免疫功能的作用[2]。臨床上，采用注射用核糖核酸Ⅱ治療肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌及宮頸癌等已有報道，而對白血病的治療及機制研究極為有限。此前有研究發現注射用核糖核酸Ⅱ具有抑制白血病K562細胞增殖的作用，而對正常細胞無明顯影響，其作用機制不清[3]。目前對注射用核糖核酸Ⅱ治療機制的研究證實，其除了具有提高免疫功能的作用外，抑制腫瘤細胞DNA的復制也是其重要的抗腫瘤機制之一[4]。DNA損傷激活凋亡相關信號通路、誘導細胞凋亡是多種抗癌藥物療效的重要機制[5]。p53作為腫瘤抑制因子，在DNA損傷誘導細胞凋亡過程中具有關鍵作用[6]。注射用核糖核酸Ⅱ抑制K562細胞增殖的作用是否與誘導白血病細胞凋亡有關尚未見報道。因此我們的研究擬通過體外實驗驗證注射用核糖核酸Ⅱ對白血病細胞系K562和KG1a細胞的增殖抑制作用，以及對細胞凋亡的影響，并檢測p53及凋亡相關蛋白的表達變化，探討注射用核糖核酸Ⅱ治療白血病的機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料和試劑 人白血病細胞株(K562細胞)來源于 ATCC；人白血病細胞株(KG1a細胞)為重慶醫科大學檢驗系血液學實驗室惠贈；注射用核糖核酸Ⅱ(BP素，規格50mg)由吉林敖東藥業集團延吉股份有限公司提供；胎牛血清、RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司；Hochest 33258染液、青霉素-鏈霉素溶液(100 X)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、RIPA裂解液(強)、PMSF(100 nmol·L-1)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；6孔板和96孔板購自Falcon Plastics 公司； CCK-8試劑盒(cell counting Kit-8)購自日本株式會社同仁化學研究所；β-actin抗體、兔抗人IgG抗體購自巴傲得生物科技有限公司； p53、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3抗體購自沈陽萬類科技有限公司；PVDF膜和ECL顯色劑購自Miliproe公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人白血病K562和KG1a細胞培養基體系由90% RPMI 1640培養基加10%胎牛血清再加1%青霉素-鏈霉素溶液混合組成。所有細胞均置于37℃、5% CO2孵箱中培養，每隔24 h觀察細胞狀態，每2～3 d換液傳代。

1.2.2 注射用核糖核酸Ⅱ的配制 將500 μL高溫消毒后的DEPC水加入50 mg的注射用核糖核酸Ⅱ粉末中使之充分溶解，配制成濃度為100 g·L-1的儲存液，-20℃儲存。實驗前以100 mL·L-1的胎牛血清RPMI 1640培養基稀釋至所需濃度。

1.2.3 CCK-8方法檢測K562和KG1a細胞增殖抑制率 取對數生長期的K562或KG1a 細胞，調整細胞數為1×109·L-1，取1 mL稀釋至25 mL接種于96孔板，每孔200 μL。設空白對照組：10%胎牛血清的RPMI 1640培養基；Control組：含有細胞10%胎牛血清的RPMI 1640培養基；注射用核糖核酸Ⅱ組：加入終濃度為100、150、200 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ；每組分別設5個復孔。培養12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，輕輕震蕩使之混勻，于37℃、5% CO2飽和濕度下繼續培養2 h。在450 nm波長處檢測各孔吸光度值(A值)，并計算細胞生長抑制率和各時間點的半數抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)，以IC50為標準確定藥物最適作用濃度和時間，實驗重復3次。

抑制率/%=(AControl組-A注射用核糖核酸Ⅱ組)/(AControl組-A空白對照組)×100%

1.2.4 FCM法檢測K562和KG1a細胞凋亡 取對數生長期的K562或KG1a細胞，調整細胞數為1×109·L-1，取0.5 mL稀釋至12.5 mL接種于6孔板，每孔3 mL。實驗分組：Control組：含有細胞10%胎牛血清的RPMI 1640培養基；終濃度為100、150、200 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ，于37℃、5% CO2飽和濕度下繼續培養24 h，收集各組細胞，用預冷的0.01 mol·L-1PBS(pH 7.2)漂洗細胞2次，4℃，1 000×g，離心5 min。每組樣本測定3×104個細胞上流式細胞儀檢測采用CellQuest 軟件分析得出細胞凋亡率，實驗重復3次。

1.2.5 Hoechst 33258染色實驗 取對數生長期的K562和KG1a細胞，調整細胞數為1×109·L-1，接種于6孔板，每孔3 mL。實驗分組：Control組：含有細胞10%胎牛血清的RPMI 1640培養基；終濃度為100、150、200 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ，于37℃，5% CO2飽和濕度下繼續培養24 h，收集各組細胞，用預冷的0.01 mol·L-1PBS(pH7.2)漂洗細胞2次，4℃，1 000×g,離心5 min。加甲醇 ∶乙醇(3 ∶1)固定液固定15 min，離心去除固定液加Hoechst 33258染色液，避光室溫染色30 min，PBS洗5次，再加上PBS制成細胞懸液滴在載玻片上，50%甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察、采圖，實驗重復3次。

1.2.6 Western blot 取對數生長期的K562或KG1a細胞，調整細胞數為1×109·L-1，取0.5 mL稀釋至12.5 mL接種于6孔板，每孔3 mL。實驗分組：Control組：含有細胞10%胎牛血清的RPMI 1640培養基；終濃度為100、150、200 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ，于37℃，5% CO2飽和濕度下繼續培養24 h，收集各組細胞，用預冷的0.01 mol·L-1PBS(pH7.2)漂洗細胞2次，4 ℃, 1 000×g,離心5 min。將細胞裂解液、1% PMSF冰上混勻，加100 μL至細胞中，用槍吹打，置于冰上10 min，然后渦旋混勻，重復3次，4 ℃, 12 000×g,離心15 min，取上清液即為所提細胞總蛋白，BCA法檢測各組蛋白濃度。按每孔50 μg上樣，80 V～120 V進行SDS-PAGE凝膠電泳，250 mA 30～60 min將蛋白轉移到PVDF膜上，5% BSA溶液37℃封閉2 h，一抗孵育過夜(p53 1 ∶1 000, Bcl-2 1 ∶1 000, Bax 1 ∶500, cleaved caspase-3 1 ∶500, β-actin 1 ∶10 000)，TBST洗膜3次，每次15 min，二抗37℃孵育30 min(1 ∶10 000)，TBST洗膜3次，每次30 min，ECL發光液孵育30 s，ChemiDOC Touch imaging system(BIO-RAD)機器曝光，使用配套軟件檢測灰度值，p53、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3比β-actin灰度值。

1.3 統計學方法 本實驗采用SPSS 22.0版本統計軟件包處理。進行獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 注射用核糖核酸Ⅱ能有效抑制人白血病細胞K562和KG1a增殖 運用CCK-8法檢測注射用核糖核酸Ⅱ對K562和KG1a細胞增殖抑制率。分別用終濃度為100、150、200、250、300 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ作用于K562和KG1a細胞12、24、48 h，K562和KG1a細胞的增殖受到明顯抑制，與空白對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。注射用核糖核酸Ⅱ作用于K562細胞12,24,48 h的半數致死濃度(IC50)分別為171.6、165.0、127.9 mg·L-1，注射用核糖核酸Ⅱ作用于KG1a細胞12、24、48 h的半數致死濃度(IC50)分別為172.6、156.0、120.7 mg·L-1。由Fig 1可見，注射用核糖核酸Ⅱ對K562和KG1a細胞的抑制率呈時間效應和劑量效應。

2.2 FCM檢測注射用核糖核酸Ⅱ誘導人白血病細胞K562和KG1a細胞凋亡 FCM檢測結果顯示，100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ能夠誘導人白血病K562和KG1a細胞凋亡，其中K562細胞的凋亡率分別為9.21%、15.8%、29.36%,與空白組4.75%相比，差異具有統計學意義(P<0.05)；KG1a細胞的凋亡率分別為10.06%、56.49%、77.24%，與空白組6.91%相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。由Tab 1、2可見，K562和KG1a細胞的凋亡率隨藥物作用濃度的增加而逐漸上升，提示注射用核糖核酸Ⅱ抑制人白血病K562和KG1a細胞的增殖活性與其誘導細胞凋亡有關。

Fig 1 Inhibitory effect of ribonucleic acid Ⅱ on K562/KG1a by CCK-8 assay

A:Inhibitory effect of ribonucleic acid Ⅱ on K562 after treatment for 12,24,48 h; B: Inhibitory effect of ribonucleic acid Ⅱ on KG1a after treatment for 12,24,48 h

RibonucleicacidⅡ/mg·L-1Apoptosisrate/%04.75±0.121009.21±0.61*15015.80±4.34*20029.36±2.67*

*P<0.05vscontrol

RibonucleicacidⅡ/mg·L-1Apoptosisrate/%06.91±0.0910010.06±0.42*15056.49±5.91*20077.24±5.61*

*P<0.05vscontrol

2.3 Hoechst染色觀察人白血病細胞K562和KG1a細胞凋亡 K562和KG1a細胞經100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ誘導24 h后染色，在熒光顯微鏡下觀察可見，空白對照組發出均勻、淡藍色熒光，未見凋亡細胞；而注射用核糖核酸Ⅱ處理的各組均出現核染色質濃縮聚集、核碎裂、核邊集及發出藍白色熒光等典型的細胞凋亡特征，凋亡改變隨藥物作用濃度升高而更加明顯。

2.4 注射用核糖核酸Ⅱ誘導人白血病細胞K562和KG1a調控細胞凋亡相關蛋白的表達 K562和KG1a細胞經100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ誘導24 h后收集細胞提取總蛋白進行凝膠電泳分析。Western blot法檢測結果顯示，p53、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平隨注射用核糖核酸Ⅱ藥物濃度的增高而表達上調，而Bcl-2蛋白表達水平逐漸降低，與空白對照組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。提示注射用核糖核酸Ⅱ可能是通過上調p53調控Bcl-2/Bax的表達，激活caspase-3促進K562和KG1a細胞凋亡。

Fig 2 Effect of ribonucleic acid Ⅱ on cell apoptosis of K562 cells

A:Control; B: 100 mg·L-1; C:150 mg·L-1; D: 200 mg·L-1

Fig 3 Effect of ribonucleic acid Ⅱ on cell apoptosis of KG1a cells

A:Control; B: 100 mg·L-1; C: 150 mg·L-1; D: 200 mg·L-1

Fig 4 Hoechst 33258 staining after ribonucleic acid Ⅱ induced K562 for 24 h(The arrow points to the apoptotic cell)

A:Control;B:100 mg·L-1;C:150 mg·L-1;D:200 mg·L-1

Fig 5 Hoechst 33258 staining after ribonucleic acid Ⅱ induced KG1a for 24 h (The arrow points to the apoptotic cell)

A:Control;B:100 mg·L-1;C:150 mg·L-1;D:200 mg·L-1

Fig 6 Expression of proteins in K562 cells after ribonucleic acid Ⅱ treatment for 24 hours

A:Control;B:100 mg·L-1;C:150 mg·L-1;D:200 mg·L-1.*P<0.05vscontrol

Fig 7 Expression of proteins in KG1a cells after ribonucleic acid Ⅱ treatment for 24 hours

A:Control; B:100 mg·L-1;C:150 mg·L-1;D:200 mg·L-1.*P<0.05vscontrol

3 討論

白血病在我國的發病率為十萬分之六左右，居腫瘤發病率第6位，還因其在兒童惡性腫瘤發病率中居于前列，受到了眾多學者的關注。雖然臨床上對白血病的治療進行了不懈的努力和嘗試，采用了骨髓移植、化療等方法，但因其治療價格昂貴、配型困難、副作用多等不利因素影響了白血病的治療效果，尋找價格低廉而療效明顯的藥物迫在眉睫。注射用核糖核酸Ⅱ在抗癌及增強免疫功能方面的作用為其治療白血病提供新的方向。

目前已有臨床上采用注射用核糖核酸Ⅱ治療肝癌、肺癌等腫瘤的報道，但對其抗癌作用的機制研究較少[7]。本研究運用CCK-8法檢測注射用核糖核酸Ⅱ對慢性粒細胞白血病細胞K562和急性髓系白血病細胞KG1a的增殖抑制作用，結果提示，100～300 mg·L-1的藥物在12、24、48 h均可明顯抑制上述兩種細胞的增殖，并且對急慢性白血病細胞的抑制率均呈時間和劑量依賴性。研究不僅證實了注射用核糖核酸Ⅱ對急慢性白血病細胞的增殖抑制作用，并且在不同時間點的藥物較此前研究活性更好[3]，這可能與藥物的批次、作用時間和細胞狀態不同等因素有關。有研究報道，注射用核糖核酸Ⅱ的抗腫瘤作用與DNA損傷有關，而DNA損傷與細胞凋亡關系密切；因此注射用核糖核酸Ⅱ對白血病細胞的增殖抑制作用是否與凋亡有關值得深入研究。

研究采用了FCM和Hoechst染色兩種方法檢測了注射用核糖核酸Ⅱ對白血病細胞凋亡的影響。FCM檢測結果顯示，100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ誘導K562細胞的凋亡率分別為9.21%、15.8%、29.36%；KG1a細胞的凋亡率分別為10.06%、56.49%、77.24%，提示注射用核糖核酸Ⅱ能有效誘導急慢性白血病細胞的凋亡。與此同時，采用相同濃度的注射用核糖核酸Ⅱ誘導急慢性白血病細胞，出現了核染色質濃縮聚集、核碎裂、核邊集等典型的凋亡變化，凋亡形態變化的程度與凋亡率的改變一致；但注射用核糖核酸Ⅱ誘導白血病細胞凋亡的機制尚不清楚。

p53是人體抑癌基因，其失活對腫瘤的形成具有舉足輕重的作用，因而成為藥物治療白血病機制研究中的關鍵靶點[8]。p53可在DNA受損后通過維持基因組穩定參與DNA的修復過程[9]。p53可通過影響Bcl-2/Bax和cleaved caspase-3等蛋白的表達和活性實現對細胞凋亡過程的調控作用[10]。Bcl-2基因是惡性腫瘤中最為重要的抗凋亡基因，Bax基因通過組成同源二聚體或與Bcl-2組成異源二聚體抑制Bcl-2的作用而發揮促進細胞凋亡的功能[11-12]。caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶, 是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路[13]。Bcl-2/Bax通過促進細胞色素C在內的多種促凋亡蛋白的釋放，激活caspase家族，產生caspase級聯反應導致細胞凋亡的發生[14]。本實驗采用100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ分別誘導K562和KG1a細胞24h后的蛋白印跡結果顯示，p53、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平隨注射用核糖核酸Ⅱ藥物濃度的增高而表達上調，而Bcl-2蛋白表達水平降低，提示注射用核糖核酸Ⅱ可能是通過上調p53來調控Bcl-2/Bax的表達，激活caspase-3進而對K562和KG1a細胞的凋亡產生影響，而注射用核糖核酸Ⅱ又是通過何種機制上調p53表達調控細胞凋亡的發生還需要進一步的研究證實。

綜上所述，注射用核糖核酸Ⅱ可通過誘導細胞凋亡發揮其抑制急慢性白血病細胞的增殖作用，而其凋亡的機制與上調p53，調控Bcl-2/Bax的表達，激活caspase-3有關，深入探討p53上下游凋亡有關的信號分子改變可為注射用核糖核酸Ⅱ治療白血病提供實驗依據。

(致謝：此研究在重慶醫科大學基礎醫學院組織細胞工程與干細胞研究室及解剖學教研室實驗室完成，特此感謝！)

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Ribonucleic acid Ⅱ induces apoptosis in human leukemia cells by up-regulating p53

GUO Pei1,2,RAN Jian-hua2,3,LI Jing1,CHEN Di-long1,YANG Bao-xue4,HE Fei2,3,XIONG Wei1,SHI Xue-ping1,LI Hai-xing1

(1.LaboratoryofStemCellsandTissueEngineering,CollegeofBasicMedicine;2.DeptofAnatomy;3.NeuroscienceResearchCenter,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016; 4.DeptofPharmacology,SchoolofBasicMedicalScience,Beijing100191)

Aim To investigate the effect of ribonucleic acid Ⅱon apoptosis in human leukemia cell lines K562 and KG1a.Methods Cell counting kit-8(CCK-8) assay was performed to detect proliferation activity of K562 and KG1a cells treated with ribonucleic acidⅡ. Apoptosis index was assessed by flow cytometry(FCM) and fluorescent Hoechst 33258 staining was used for observing morphologic changes of apoptosis. Expression levels of p53,Bax,Bcl-2 and cleaved caspase-3 were analyzed by Western blot.Results The proliferation of K562 and KG1a cells was significantly inhibited by ribonucleic acid Ⅱ treatment for 12 h, 24 h, 48 h at concentrations of 100～300 mg·L-1, which indicated the inhibitory effect of ribonucleic acid Ⅱ was in dose-dependent and time-dependent manners. FCM results displayed a dose-dependent increase in cell apoptotic rate. Hoechst 33258 staining showed the typical apoptotic morphology in some leukemic cells treated with ribonucleic acid Ⅱ, including increased nuclear chromatin concentration and edge accumulation. Western blot analysis showed the increased expression of p53, Bax, cleaved caspase-3 and decreased expression of Bcl-2 in K562 and KG1a cells treated with ribonucleic acid Ⅱ.Conclusions Ribonucleic acid Ⅱ can induce apoptosis of leukemia K562 and KG1a cells by up-regulating p53, which mediates Bcl-2/Bax balance and activates caspase-3.

ribonucleic acid Ⅱ;leukemia;p53; K562 cells; KG1a cells; apoptosis

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.036.html

2016-08-05，

2016-09-29

重慶市科技計劃資助項目(No cstc2015jcyjA0036)

郭 珮(1991-)，女，碩士生，研究方向：白血病基礎與臨床,E-mail:930029089@qq.com; 冉建華(1974-)，女，博士，教授，研究方向：尿素通道蛋白生理功能及藥物開發,通訊作者,E-mail:ranjianhua2013@163.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.018

A

1001-1978(2016)12-1729-06

R329.24；R329.25；R342.2；R733.7；R979.1