京尼平苷及其體內代謝產物京尼平對HepG2細胞毒性的比較及機制研究

任艷青，田宇柔，李 琛，何穎娜，麻景梅，牛麗穎，王鑫國

(河北中醫學院中藥藥理學實驗室，河北省中藥配方顆粒工程技術研究中心，河北省高校中藥配方顆粒應用技術研發中心，河北 石家莊 050091)

京尼平苷及其體內代謝產物京尼平對HepG2細胞毒性的比較及機制研究

任艷青，田宇柔，李 琛，何穎娜，麻景梅，牛麗穎，王鑫國

(河北中醫學院中藥藥理學實驗室，河北省中藥配方顆粒工程技術研究中心，河北省高校中藥配方顆粒應用技術研發中心，河北 石家莊 050091)

目的 通過比較京尼平苷(geniposide，GS)及其體內代謝產物京尼平(genipin，GP)的HepG2 肝細胞毒性，進一步明確中藥梔子致肝毒性的物質基礎，并探討其毒性作用機制。方法 采用MTT法檢測不同濃度GS與GP的細胞毒作用；試劑盒法測定細胞中錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、過氧化氫酶(CAT)活力及谷胱甘肽(GSH)含量；二乙酸-2′，7′-二氯熒光素(DCFH-DA)染色法測定胞內活性氧(ROS)的變化；高內涵細胞分析技術(high content screening，HCS)進行多參數細胞毒性(細胞數量、核尺寸及形態、核DNA含量、細胞膜通透性、線粒體膜電位和細胞色素C)分析。結果 GS(20～1 000 μmol·L-1)對HepG2細胞無明顯細胞毒作用(P>0.05)，50 μmol·L-1GP可明顯抑制HepG2細胞增殖(P<0.05)，IC50值為(450.00 ± 26.15)μmol·L-1；GS對胞內Mn-SOD、CAT、GSH、ROS含量無明顯影響(P>0.05)，GP孵育細胞后，引起胞內Mn-SOD、CAT活性明顯下降，GSH含量明顯降低，并可明顯增加ROS的生成(P<0.05或P<0.01)；50、500、1 000 μmol·L-1GP可明顯降低線粒體膜電位，促進細胞色素C的釋放，升高細胞膜通透性(P<0.05或P<0.01)，500、1 000 μmol·L-1GP組還可觀察到明顯的核固縮以及核熒光強度的升高，細胞數量的明顯下降(P<0.01)，1 000 μmol·L-1GS對上述細胞毒性參數無明顯影響(P>0.05)。結論 GP是梔子致肝細胞毒性的直接物質基礎，氧化應激所導致的線粒體損傷與細胞凋亡是GP引起肝毒性的主要機制。

梔子；京尼平苷；京尼平；藥物性肝損傷；氧化應激；線粒體損傷；細胞凋亡；高內涵分析

梔子為茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實，為保肝利膽的常用中藥。京尼平苷(geniposide，GS)即梔子苷，是其含量最高的環烯醚萜苷類物質，臨床常用于急慢性肝損傷、酒精性肝病、膽汁淤積性肝損傷、慢性肝炎、肝纖維化、非酒精性脂肪肝、肝功能衰竭、肝癌等肝臟疾病的治療[1-2]，現代藥理研究發現京尼平苷還具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗抑郁、神經保護、抗血管生成[3-5]等廣泛的藥理活性。近些年來，不少學者研究發現，實驗動物長期大劑量灌服梔子具有明顯的肝毒性[6-10]，其肝毒性問題一直是阻礙臨床用藥的主要問題。目前，梔子引起肝毒性物質基礎及毒效機制尚不明確，有學者提出京尼平(genipin，GP)苷是梔子肝毒性的主要物質基礎，也有學者推測梔子所導致的肝毒性是由其體內代謝產物京尼平所引起，但尚缺乏直接的實驗支持。本研究將不同濃度的京尼平苷與京尼平作用于人肝癌HepG2細胞，通過比較二者的肝細胞毒性，進一步明確梔子肝毒性的物質基礎，并在此基礎上，基于建立的高內涵多參數細胞毒性分析方法，從氧化應激損傷角度探討其毒性作用機制，為梔子的安全性評價提供更多實驗依據，同時也為尋找減輕梔子肝毒性的藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 京尼平苷(批號140815，純度98%)、京尼平(批號141207，純度98%)購自南京狄爾格醫藥科技有限公司，均以DMSO配制成0.1 mol·L-1儲備液，無血清DMEM培養基梯度稀釋至工作濃度。高糖DMEM、胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT、DMSO購自美國Amresco公司；超氧化物歧化酶(SOD)分析測試盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、微量還原型谷胱甘肽(GSH)測試盒、活性氧(ROS)測試盒，均購自南京建成生物工程研究所；多參數細胞毒性檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。1.2 儀器 MCO-15AC CO2培養箱(日本SANYO)；超凈工作臺(力康生物醫療科技控股有限公司)；TGL-16臺式高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；DMI 3000 B倒置熒光顯微鏡(德國Leica)；150-96超聲波破碎儀(賽飛中國有限公司)；Multiskan FC酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific)；VTI700高內涵細胞分析系統(美國Thermo Fisher Scientific)。

1.3 細胞及細胞培養 人肝癌HepG2細胞，購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫。采用高糖DMEM培養基(含體積分數為0.1 胎牛血清、1×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)，5% CO2、37 ℃飽和濕度培養箱培養，細胞為貼壁生長，細胞生長至80%匯合時即可用胰酶消化傳代，實驗選用對數生長期細胞。

1.4 MTT法檢測細胞毒性 HepG2細胞接種于96孔培養板，每孔約5 000個細胞，待細胞貼壁后，同步化處理24 h，加入不同濃度的GS、GP(濃度梯度均為20、50、100、250、500、1 000 μmol·L-1)，每個濃度設6個復孔，作用24 h后，每孔加入MTT 繼續培養4 h，小心吸棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩使結晶充分溶解，酶標儀570 nm處測定吸光度OD值，計算細胞存活率(存活率/%=OD實驗組/OD對照組×100%)，并根據藥物濃度對應細胞增殖抑制率作線性回歸，計算IC50值，即藥物抑制50%細胞增殖時的濃度，實驗重復3次。

1.5 試劑盒法測定細胞中Mn-SOD、CAT、GSH水平 HepG2細胞以每瓶5×105個接種于25 cm2培養瓶中，GS、GP濃度梯度均為50、100、250、500、1 000 μmol·L-1，培養24 h后，用細胞刮將細胞刮下，離心收集細胞，超聲破碎后按照Mn-SOD、CAT、GSH檢測試劑盒說明書操作，計算細胞Mn-SOD、CAT活力及GSH含量。

1.6 熒光探針DCFH-DA 法檢測ROS水平 參照文獻[11]方法，以1×108·L-1密度接種細胞于96孔板，每孔100 μL，24 h后分別加入1 000 μmol·L-1GS，50、500、1 000 μmol·L-1GP，培養24 h，藥物作用時間結束后，吸棄培養基，加入30 μmol·L-1DCFH-DA探針50 μL每孔，繼續孵育30 min，PBS洗滌3次后，選擇激發波長485 nm，發射波長525 nm，于高內涵細胞分析系統觀察細胞內ROS 染色，檢測細胞平均熒光強度值。

1.7 HCS技術進行多參數細胞毒性分析 細胞接種(密度5×107·L-1、3復孔/組)、同步化、藥物干預(1 000 μmol·L-1GS，50、500、1 000 μmol·L-1GP)24 h，吸棄培養液，加入活細胞染液(含非膜通透性細胞核染料和線粒體膜電位染料)每孔50 μL，置于培養箱內孵育30 min；室溫進行固定、透化、封閉處理，依次加入細胞色素C小鼠單克隆一抗(1 ∶400)、DyLightTM649 羊抗鼠IgG(1 ∶500)二抗及Hoechst 33342，清洗后開啟HCS系統，設定10倍物鏡，每孔掃描16個視野，每種染料的掃描波長設定如下：Hoechst 33342：激發/發射光波長350/461 nm、非膜通透性細胞核染料：激發/發射光波長491/509 nm、線粒體膜電位染料：激發/發射光波長552/576 nm、細胞色素C：激發/發射光波長646/674 nm，并設定每一通道的聚焦位置及曝光強度參數，對每個孔逐一進行掃描，進行多參數細胞毒性分析：細胞數量、核尺寸及形態、核DNA含量、膜通透性、線粒體膜電位(MMP)、細胞色素C含量(其中，核DNA含量、膜通透性、MMP、細胞色素C均以細胞的平均熒光強度值表示)。

2 結果

2.1 京尼平苷及其體內代謝產物京尼平對HepG2細胞的細胞毒作用 京尼平苷(20～1 000 μmol·L-1)濃度范圍內對HepG2細胞無明顯細胞毒作用(P>0.05)；50、100、250、500、1 000 μmol·L-1京尼平可使細胞存活率明顯下降(P<0.05或P<0.01)，細胞存活率依次為(90.19 ± 5.04)%、(77.84 ± 7.76)%、(66.84 ± 6.55)%、(51.60 ± 6.62)%、(30.66 ± 4.48)%，見Fig 1。實驗結果表明，京尼平對HepG2細胞有明顯的細胞毒作用，且隨濃度的增加，細胞毒作用增強，毒性作用呈濃度依賴性，IC50值為(450.00 ± 26.15)μmol·L-1。

Fig 1 Cytotoxic effects of GS and its metabolite GP on

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.2 京尼平苷及其體內代謝產物京尼平對胞內Mn-SOD、CAT、GSH水平的影響 不同濃度的京尼平苷(50、100、250、500、1 000 μmol·L-1)處理HepG2細胞后，對胞內Mn-SOD、CAT活力及GSH含量均無明顯影響(P>0.05)；50、100、250、500、1 000 μmol·L-1京尼平可明顯降低胞內Mn-SOD、CAT活性及GSH含量(P<0.05或P<0.01)，且此作用隨京尼平濃度的增加越明顯，見Fig 2。

Fig 2 Effects of GS and its metabolite GP on levels of Mn-SOD,

*P<0.05,**P<0.01 vscontrol

2.3 京尼平苷及其體內代謝產物京尼平對胞內ROS水平的影響 對照組HepG2細胞熒光強度很弱，表明細胞內活性氧的量很少；1 000 μmol·L-1京尼平苷對細胞內活性氧水平無明顯影響(P>0.05)；50、500、1 000 μmol·L-1京尼平孵育HepG2細胞后，細胞熒光強度明顯增強(P<0.01)，說明京尼平可以誘導細胞內總活性氧水平明顯升高，并呈現明顯的濃度依賴性，見Fig 3。

Fig 3 Effects of GS and its metabolite GP on ROS levels

**P<0.01vscontrol

2.4 京尼平苷及其體內代謝產物京尼平對HepG2細胞多參數細胞毒性的影響 正常對照組細胞線粒體膜電位正常，細胞色素C釋放較少，細胞膜通透性低，核形態完好，熒光強度低；1 000 μmol·L-1京尼平苷孵育細胞，對以上指標均無明顯影響(P>0.05)，未觀察到明顯的凋亡特征，提示京尼平苷的細胞毒性不明顯，與MTT結果具有較好的一致性。50 μmol·L-1京尼平可明顯降低線粒體膜電位(P<0.01)，促進細胞色素C的釋放(P<0.01)，升高細胞膜通透性(P<0.05)，提示京尼平可誘導細胞發生早期凋亡；500、1 000 μmol·L-1京尼平除對線粒體及通透性有影響外，還可觀察到細胞核的固縮及核內染色質的凝集(P<0.01)，核熒光強度明顯升高(P<0.01)以及細胞數量的明顯下降(P<0.01)，提示京尼平誘導細胞發生晚期凋亡，通過高內涵分析可發現，京尼平對HepG2細胞具有明顯的細胞毒作用，毒性作用機制與其導致的線粒體損傷與細胞凋亡有關，見Fig 4。

Fig 4 Effects of GS and its metabolite GP on multiparameter cytotoxicity in HepG2 cells by HCS assays (×100) ±s,n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 討論

近些年來，中藥及其成分引起的藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)發病率逐年升高[12]，越來越引起國內外學者的重視。因此，通過現代毒理學研究手段，闡明中藥肝毒性的物質基礎及毒性作用機制對于防治中藥源性肝損傷具有重要的意義。高內涵分析技術(high content screening，HCS)現已成為國際通用的DILI研究手段[13]，Persson等[14]采用HCS技術對100種已知肝毒性藥物(對氨基水楊酸、碘胺酮等)的HepG2細胞毒性進行了重新評估。Tolosa等[15]也以HepG2細胞為觀察對象，采用HCS技術對78種肝毒性成分(炔雌醇、碘胺酮等)作用于HepG2細胞3、24 h毒性進行了分析，均顯示HCS技術在DILI及毒性作用機制研究中具有高度的敏感性與特異性[16]。

梔子導致的DILI已被共識，不少學者從整體動物水平探討了梔子水提物、醇提物及京尼平苷所導致的肝損傷。本研究以HepG2細胞為對象，對比分析京尼平苷及其代謝產物京尼平的肝細胞毒性差異，發現不同濃度的京尼平苷孵育HepG2細胞，均未產生明顯的細胞毒作用，提示京尼平苷不是梔子產生肝毒性的物質基礎。京尼平對HepG2細胞具有明顯的肝細胞毒性，毒性作用呈濃度依賴性，IC50值為(450.00 ± 26.15)μmol·L-1，明確了京尼平是引起肝毒性的直接物質基礎，可以推論梔子的肝毒性是梔子藥材中的京尼平苷經腸道細菌β-葡萄糖苷酶水解后的代謝產物京尼平所引起，與文獻推測一致[4]。

氧化應激損傷是中藥源性DILI的主要機制[17]，氧化應激是指ROS的產生與機體內抗氧化防御系統的清除之間失衡[18]。Mn-SOD、CAT、GSH是體內重要的抗氧化系統[12,17]，為了明確京尼平導致的DILI與氧化應激的關系，我們測定了胞內Mn-SOD、CAT活力及GSH、ROS含量，發現京尼平可明顯降低Mn-SOD、CAT活性及GSH含量，說明細胞抗氧化能力下降，同時伴隨著ROS的大量增多，說明京尼平誘導的肝細胞毒性與氧化應激密切相關。線粒體是氧化應激損傷的重要靶細胞器[19]，線粒體膜電位的變化可以反映出線粒體受損的程度，并被認為是細胞凋亡的早期事件，同時由于線粒體的損傷導致細胞色素C的大量釋放[20]，進而觸發細胞凋亡級聯反應，引起細胞的凋亡。我們采用國際先進的HCS體外毒性評價技術，從線粒體功能及細胞凋亡的角度對京尼平所導致的肝細胞毒性進行了分析，通過HCS多參數細胞毒性測定對線粒體膜電位、細胞色素 C 含量、膜通透性、核尺寸及形態、核DNA含量、細胞數量等指標進行同時分析。在研究中，我們發現，50 μmol·L-1京尼平組細胞線粒體膜電位下降，大量細胞色素C釋放到胞質中，細胞膜通透性明顯增加，提示線粒體膜電位水平、細胞色素C含量及細胞膜通透性是京尼平誘導細胞凋亡的早期敏感性指標；隨著京尼平孵育濃度的加大，還伴隨著核形態的破壞，表明京尼平可誘導細胞發生晚期凋亡，而京尼平苷未觀察到明顯的肝細胞毒性。

通過以上研究可以發現，京尼平具有明顯的肝細胞毒性作用，是梔子致肝毒性的直接物質基礎，氧化應激所導致的線粒體損傷與細胞凋亡是京尼平引起肝毒性的主要作用機制之一。以上研究結果為梔子的安全性評價提供了資料，為梔子的臨床合理應用提供了實驗依據，有關京尼平對線粒體凋亡通路相關蛋白表達的影響，課題組正在進一步深入研究。

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Cytotoxic effect of geniposide and its metabolite genipin on HepG2 cells and mechanism

REN Yan-qing,TIAN Yu-rou,LI Chen,HE Ying-na,MA Jing-mei,NIU Li-ying,WANG Xin-guo

(PharmacologicalLabofTraditionalChineseMedicine,HebeiUniversityofChineseMedicine,HebeiTCMFormulaGranuleEngineering&TechnologyResearchCenter,TCMFormulaGranuleResearchCenterofHebeiProvinceUniversity,Shijiazhuang050091,China)

Aim To compare the cytotoxicity of geniposide (GS) and its metabolite genipin (GP) on human hepatocelluar HepG2 cells and explore the substance and mechanism of hepatotoxicity induced byFructusGardeniae. Methods The cytotoxic effect of GS and GP was analyzed by MTT method; the antioxidant enzyme activities of manganese superoxide dismutase (Mn-SOD), catalase (CAT) and levels of glutathione (GSH) were detected by respective kits; the change of intracellular reactive oxygen species (ROS) was measured by 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) staining method; multiparameter cytotoxicity analysis (cell loss, nuclear size and morphological changes, DNA content, cell membrane permeability, mitochondrial membrane potential changes, cytochrome C release) were measured simultaneously by high content screening (HCS) assays. Results No cytotoxicity was found in GS (20～1 000 μmol·L-1) groups (P>0.05) , but GP was found to exert obvious cytotoxic effect, and 50 μmol·L-1GP could obviously inhibit HepG2 cell proliferation (P<0.05), and the IC50value was (450.00 ± 26.15) μmol·L-1; GS showed no obvious effects on Mn-SOD, CAT, GSH, ROS (P>0.05) , GP could significantly decrease the activity of Mn-SOD, CAT and the level of GSH, and obviously increase the content of ROS (P<0.05 orP<0.01); treatment with 50, 500, 1 000 μmol·L-1GP resulted in loss of mitochondrial membrane potential, cytochrome C release and increased cell permeability (P<0.05 orP<0.01), 500, 1 000 μmol·L-1GP could also show abvious nuclear condensation, increased total nuclear intensity and cell loss (P<0.01). Opposed with GP, GS had no significant effect on the cytotoxic parameters (P>0.05). Conclusion GP is the direct substance of hepatotoxicity induced byFructusGardeniae, and the mechanism might be associated with oxidative stress, mitochondria injury and apoptosis.

FructusGardeniae; geniposide; genipin; drug-induced liver injury; oxidative stress; mitochondria injury; cell apoptosis; high-content screening assays

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.046.html

2016-06-27，

2016-08-31

河北省自然科學基金資助項目(No H2014206302)；河北省中醫藥管理局科研計劃項目(No 2014007)；河北中醫學院青年教師科研基金項目(No QNZ2014007)

任艷青(1984-)，女，碩士，研究方向：中藥藥理學，Tel：0311-89926307，E-mail：renyanqing2006@163.com； 王鑫國(1966-)，男，教授，研究方向：中藥藥理學，通訊作者，Tel：0311-89926208，E-mail：wangxinguozy@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.023

A

1001-1978(2016)12-1755-07

R284.1；R322.47；R329.24；R329.25；R991