在肝臟腫大和產蛋率下降綜合征病雞中檢出禽戊型肝炎病毒核酸

劉寶元 ， 孫亞妮 ， 陳宜陽 ， 趙 欽 ， 周恩民

(西北農林科技大學動物醫學院 農業部獸用藥物與獸醫生物技術陜西科學觀測實驗站， 陜西楊凌712100)

在肝臟腫大和產蛋率下降綜合征病雞中檢出禽戊型肝炎病毒核酸

劉寶元 ， 孫亞妮 ， 陳宜陽 ， 趙 欽 ， 周恩民

(西北農林科技大學動物醫學院 農業部獸用藥物與獸醫生物技術陜西科學觀測實驗站， 陜西楊凌712100)

為弄清遼寧某蛋雞場雞只產蛋量突然下降， 死亡率上升及部分剖檢雞只肝臟腫大出血的原因， 對采集的發病雞肝臟組織進行病理學觀察， 同時對腸道內容物進行禽戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus, HEV)核酸片段的RT-PCR檢測。 肝臟的組織病理學觀察發現， 肝細胞壞死和匯管區周圍淋巴細胞浸潤；RT-PCR從腸道內容物中成功擴增到禽HEV ORF2基因的部分片段；基因序列同源性分析結果表明， 其與國內禽HEV參考株的序列同源性為97.5%～99.6%， 而與其他國家的HEV序列同源性為77.9%～97.6%；進化樹分析表明， 該序列(命名為China 15-LN)與國內其他地區及歐洲的部分分離株在同一進化分支上， 同屬禽HEV基因3型。

禽戊型肝炎病毒 ； 分離鑒定 ； 序列分析

禽戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEV)是雞的大肝大脾病(Big liver and spleen disease, BLS)或肝炎脾大綜合征(Hepatitis-Splenomegaly, HS)的主要病原，該病主要引起30～72周齡的蛋雞和肉種雞產蛋率下降(20%～40%)和死淘率升高(1%～4%)，部分雞腹部充血、卵巢退化、偶有肝脾腫大，是危害養禽業尤其是蛋雞和種禽養殖業發展的重要疾病之一[1]。許多國家先后有過BLS或HS綜合征暴發的報道[2-9]。

2015年7月遼寧某海藍褐蛋雞場的雞只(30周齡)產蛋率突然下降約30%，同時伴隨死淘率上升4%左右，部分雞只剖檢癥狀表現肝臟腫大、出血和壞死。依據臨床表現和剖檢病變，初步懷疑為由禽HEV感染引發的雞BLS。隨后，通過對病死雞肝臟的病理學觀察和對腸道內容物中禽HEV核酸的RT-PCR檢測進行實驗室診斷。結果發現，肝臟的肝細胞嚴重壞死并且匯管區周圍出現嚴重的淋巴細胞浸潤，而腸道內容物中也擴增到禽HEV核酸片段。試驗結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 解剖學及病理學觀察 對病死雞進行剖檢，肉眼觀察肝臟組織的病變，同時取小塊肝組織于10%福爾馬林液固定，常規方法制作石蠟切片并進行 H.E.染色。最后在普通光學顯微鏡下觀察病理學變化。

1.2 病毒基因的克隆擴增與序列分析

1.2.1 樣品采集與處理 收集病死雞腸道內容物，用無菌PBS(pH值=7.2)按照質量體積比制成10%懸浮液，3 500 r/min(4℃)離心10 min，吸取200 μL上清液用于病毒RNA提取。

1.2.2 樣品中禽HEV RNA檢測 參考Z F Sun等的方法[10]，合成擴增ORF2部分序列的巢式PCR引物，目的片段分別為278 bp和242 bp。首先按照TRIZol和Superscript II 反轉錄酶(Invitrogen)的使用說明書，從200 μL腸道內容物上清液中進行總RNA的提取與反轉錄。然后按照Transtaq High Fidelity DNA 聚合酶(TransGen Biotech)說明書進行巢式PCR擴增，最后取5 μL PCR產物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像系統下觀察并拍照記錄結果。

1.2.3 序列測定與分析 按照EasyPure Quick Gel Extraction試劑盒(TransGen Biotech)的說明書對PCR產物進行凝膠回收純化，然后與pMD18-T Vector連接，陽性質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將獲得的序列利用DNAStar軟件進行分析，并與GenBank上禽HEV的參考序列進行同源性和進化樹分析。所用參考序列的GenBank登錄號為：GQ398041，GQ398042，AY870827，FM872317，FM872312，AY870829，EU919193和FM872314。

2 結果

2.1 病死雞肝臟的解剖學及病理學觀察 剖檢可見部分病死雞只肝臟腫大、出血(見中插彩版圖1A)。顯微鏡觀察發現，病死雞肝臟的肝細胞嚴重壞死，匯管區周圍大量淋巴細胞浸潤(見中彩插版圖1B)，呈現出典型禽HEV感染雞只后引發的肝臟顯微病理學變化。并未觀察到J亞群禽白血病引發的骨髓樣細胞瘤病變(瘤細胞胞漿內有紅染顆粒)。

2.2 禽HEV核酸檢測與分析

2.2.1 禽HEV核酸擴增 收集的樣品提取總RNA后，利用禽HEV的特異性檢測引物，巢式RT-PCR方法擴增得到了預期的目的片段，其大小為 242 bp(圖2)。

圖2 PCR擴增結果

M：Trans2K ? Plus II DNA Marker； 1-3：樣本； 4：陰性對照

2.2.2 序列分析 利用DNAStar軟件包里的MegAlign程序，將獲得的序列與GenBank上參考序列進行同源性分析，結果顯示，其與國內的禽HEV參考序列(China 09-Z56，China 09-G57)的同源性為97.5%-99.6%，與澳大利亞，美國，西班牙，德國和匈牙利等國的參考序列的同源性為77.9%-97.6%(表1)。同源性分析提示，獲得的序列為禽HEV核酸序列，命名為China 15-LN。

表1 部分禽HEV ORF2基因序列與GenBank上部分禽HEV序列同源性分析 %

利用DNAStar軟件包里的Clustal W程序構建進化樹，結果顯示，China 15-LN與國內禽HEV及歐洲的和美國部分分離株在同一進化分支上，同屬于禽HEV基因3型(圖3)。

3 討論

本次發病，蛋雞場的雞只在30周齡時出現產蛋量突然下降約30%，同時伴隨雞只死淘率上升4%左右，雞場中禽流感和新城疫抗體效價均在免疫保護范圍內，抗生素治療效果不佳。通過對病死雞進行剖檢，發現部分雞只肝臟腫大、出血，但并沒有出現大小不一的結節狀或塊狀腫瘤。依據臨床表現和剖檢病變，我們初步懷疑此次疫情可能是由禽HEV感染引發的雞BLS病。隨后我們通過對病死雞肝臟的病理學觀察和腸道內容物的RT-PCR檢測，發現肝臟呈現典型禽HEV感染雞只后引發的肝臟顯微病理學變化[11]，而腸道內容物也擴增到禽HEV RNA。實驗室診斷驗證了此次疫情是由禽HEV感染引發。

圖3 禽HEV部分ORF2基因序列構建的進化樹

禽HEV和禽白血病感染引發的臨床表現相似，但是通過對肝臟的剖檢病變和顯微病理學病變的觀察可對兩種病進行鑒別診斷。本次疫情剖檢雞只肝臟并未出現大小不一的結節狀或塊狀腫瘤，而顯微病理學也并未觀察到肝臟內出現骨髓樣細胞瘤病變[12](瘤細胞胞漿內有紅染顆粒)，說明此次疫情不是禽白血病。

同源性分析結果顯示，其(China 15-LN)與國內的禽HEV參考序列(China 09-Z56，China 09-G57)的同源性為97.5%～99.6%，與部分國家的參考序列的同源性為77.9%～97.6%。構建進化樹顯示，其與國內禽HEV及歐洲的和美國部分分離株在同一進化分支上，同屬于禽HEV基因3型。上述結果說明，我國可能仍主要存在禽HEV基因3型的感染[7]，是否存在其他基因型仍需要進一步的流行病學調查。

通過臨床和實驗室診斷可以確定該雞場此次疫情是由禽HEV感染引發的。目前尚無特效疫苗和治療藥物，但是禽HEV屬于自限性疾病，產蛋量下降通常會持續3-10周，然后會恢復到接近正常水平，但是如果與其他病原混合感染可能誘發更嚴重的疾病表現。所以該雞場首先應該及時清理傳染源，加強飼養管理，避免進一步感染健康雞，減少經濟損失；其次減少應激，避免雞群免疫力下降；最后雞群飼喂保肝護肝藥物，增強群體免疫力。

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2016-03-16

國家自然科學基金(31372464；31402233)；西北農林科技大學基本科研(2452016048)

劉寶元(1985- )，男，博士生，主要從事分子病原學與獸醫免疫學的研究，E-mail:lby358891054@126.com

周恩民，E-mail:zhouem@nwsuaf.edu.com

S852.65

A

0529-6005(2016)11-0035-03