葛根素對熱應激致牛睪丸支持細胞氧化損傷的保護作用

叢 霞 ， 張東君 ， 任婷婷 ， 張 倩 ， 朱麗萍 ， 李 琪 ， 曹榮峰 ， 田文儒 ， 李華濤

(1.青島農業大學動物科技學院， 山東青島266109 ； 2.肥城市畜牧獸醫局山東肥城271600)

葛根素對熱應激致牛睪丸支持細胞氧化損傷的保護作用

叢 霞1， 張東君2， 任婷婷1， 張 倩1， 朱麗萍1， 李 琪1， 曹榮峰1， 田文儒1， 李華濤1

(1.青島農業大學動物科技學院， 山東青島266109 ； 2.肥城市畜牧獸醫局山東肥城271600)

葛根素(Pue)是從中藥野葛或甘葛藤根中提取的黃酮類化合物， 有明顯的抗氧化功能。 Pue是否有對熱應激時牛睪丸支持細胞 (SCs)保護作用尚不清楚。 本研究采用42 ℃熱應激1 h， 然后34 ℃恢復6 h。 用CCK-8檢測細胞存活率； 用Hoechst33258檢測細胞凋亡； 用分光光度法檢測細胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)的變化， 以及Western-Blot檢測HSP70蛋白表達。 結果顯示， 熱應激后細胞存活率下降， 細胞發生凋亡， 產生氧化損傷。 葛根素和維生素E可以極顯著降低熱應激時細胞MDA含量， 顯著增加SOD、 CAT和GSH-Px活力。 Pue與維生素E組相比無顯著性差異。 此外， 葛根素可顯著增加受熱應激SCs中HSP70蛋白的表達。 上述結果表明， 葛根素能減少熱應激下SCs的氧化損傷， 其機制可能與提高抗氧化酶活性及增加熱休克蛋白HSP70的表達有關。

牛睪丸支持細胞； 葛根素； 熱應激； HSP70 ；氧化損傷

夏季環境溫度過高，能直接或間接影響雄性家畜的精子活力，能使種公畜精液品質下降，從而降低繁殖力。睪丸支持細胞(Sertoli Cells，SCs)又稱為精子的保育細胞，參與構成血睪屏障，在生殖過程中起著重要作用，支持細胞數量多少和質量高低直接決定著雄性的生殖功能[1]。睪丸對高溫較敏感，熱應激能誘發豬睪丸細胞氧化損傷[2]，使小鼠睪丸質量下降，生精細胞凋亡[3]，據報道，葛根素對缺血再灌注損傷保護作用顯著，并有較強的抗氧化作用，對H2O2誘導的心肌細胞氧化應激損傷保護效果明顯[4]，但是葛根素能否緩解熱應激所致的SCs的氧化損傷作用，目前還未見報道。本研究觀察葛根素對熱應激誘導的SCs氧化損傷的影響，揭示葛根素對SCs細胞受熱應激的影響及其可能的作用機制，為預防動物夏季熱應激尋找方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 葛根素(江西本草天工)；維生素E(Sigma)；CCK-8細胞活力檢測試劑盒、MDA、SOD、GSH-Px、CAT檢測試劑盒(南京建成生物工程公司)； Hoechst33258染色液(碧云天生物技術研究所)；HSP70、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體和兔抗羊、羊抗兔IgG-HRP分別購自Santa Cruze公司和Jackson ImmunoResearch公司；Easy See Western Blot Kit試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)。

1.2 SCs的培養、熱應激處理及分組 復蘇已鑒定凍存的原代SCs[5]，用含13%FBS的DMEM/F-12培養基在34 ℃含5%CO2的飽和濕度條件下培養，在細胞覆蓋率達80%～90%時傳代，傳到三代時用于試驗。將細胞分為34 ℃對照(Ⅰ)組；34 ℃+Pue(Ⅱ)組；42 ℃熱應激(Ⅲ)組；添加葛根素(IV)組。IV組細胞分別在添加葛根素和維生素E培養24 h后，42 ℃熱應激1 h，然后34 ℃恢復6 h。

1.3 葛根素和維生素E最佳濃度的篩選 SCs細胞1×104/孔接種于96孔培養板，培養24 h，將細胞分為空白組、藥物組(葛根素5，10，15，20，30，35 μmol/L和40 μmol/L；維生素E 20，25，40，60，80 μmol/L和100 μmol/L)及本底組。在34 ℃下培養24 h，用CCK-8法檢測細胞活力，嚴格按照說明書操作酶標儀450 nm測吸光值。細胞存活率(T/C﹪)=(藥物組OD-本底對照組OD)/(空白對照組OD-本底對照組OD)×100%。

1.4 葛根素對熱應激后SCs存活率的影響 含葛根素(0，15，20，40，60，80，100 μmol/L)的培養基培養細胞24 h后，用42 ℃熱應激1 h，然后恢復培養6 h，最后用CCK-8檢測細胞存活率(方法同1.3)。

1.5 Hoechst33258熒光染色檢測SCs核凋亡 制作細胞爬片后，將細胞熱應激處理，用4%多聚甲醛室溫固定，再用Hoechst33258染液在37 ℃避光條件下染色10 min，沖洗后加抗熒光淬滅劑，蓋片后用熒光顯微鏡下觀察細胞核。1.6 MDA含量及SOD、GSH-Px和CAT活性的檢測 用0.25%胰酶消化各處理組細胞并取細胞沉淀，超聲破碎后，按照相應試劑盒說明檢測MDA含量及SOD、GSH-Px和CAT活性。

1.7 SCs中HSP70蛋白表達的檢測 用Western-Blot檢測HSP70蛋白表達，實驗步驟參照國曉瞳等進行操作[5]。

2 結果與分析

2.1 熱應激誘導SCs凋亡 熒光顯微鏡觀察發現，42 ℃熱應激組細胞核由于濃集而呈亮藍色，細胞核形態不規則，有破碎(圖1，A)；而正常組細胞核呈圓形、淡藍色，形態正常，內有較深藍色顆粒(圖1，B)。在相同熒光強度下，42 ℃熱應激組細胞熒光強度高于正常組。

圖1 Hoechst33258熒光染色顯示熱應激組(A)和對照組(B)

2.2 葛根素和維生素E濃度對SCs活力的影響 葛根素濃度在0～15 μmol/L時，細胞存活率均比空白組增加，而隨著葛根素濃度增加，細胞存活率逐漸下降(圖2，A)。維生素E濃度在0～25 μmol/L間與空白組相比，細胞存活率上升，但隨著濃度增加，細胞存活率逐漸下降(圖2，B)。因此本試驗分別選擇15 μmol/L(Pue)和25 μmol/L(維生素E)作為后續細胞處理濃度。

圖2 不同濃度的葛根素(A)及維生素E(B)處理對SCs存活率的影響

2.3 葛根素對SCs存活率的影響 受熱應激后，SCs存活率(80.67%)極顯著(P<0.01)下降(圖3)，當葛根素濃度為15 μmol/L時，細胞存活率增加，細胞存活率為90.97%。隨葛根素濃度增加(20-100 μmol/L)，細胞存活率逐漸降低。

圖3 不同濃度葛根素預處理對熱應激SCs存活率的影響

2.4 葛根素對SCs內MDA含量及SOD、GSH-PX和CAT活力的影響 結果如表1所示，與34 ℃對照組相比，42 ℃熱應激組細胞(P<0.01)和42 ℃+Pue組細胞(P<0.05)內MDA含量均顯著升高；與 42 ℃ 熱應激組相比，42 ℃+Pue組和42 ℃+維生素E組細胞MDA含量均極顯著(P<0.01)降低；42 ℃+Pue和+維生素E組之間無顯著差異(P>0.05)。與34 ℃對照組相比，42 ℃熱應激組細胞SOD、GSH-Px和CAT活力均極顯著降低(P<0.01)；與42 ℃對照組相比，42 ℃+Pue組和42 ℃+維生素E組細胞內上述指標則顯著升高(P<0.05)；42 ℃+Pue組和42 ℃+維生素E組細胞間則無顯著差異(P>0.05)。

表1 葛根素對牛睪丸支持細胞MDA含量及SOD、GSH-Px和CAT活性的影響

注：同列數據相比，大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，大寫字母相同，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，大小寫字母都相同表示差異不顯著(P>0.05)

2.5 葛根素對SCs中HSP70蛋白表達的影響 與34 ℃對照組相比，42 ℃組以及42 ℃+Pue組HSP70蛋白表達極顯著增加(P<0.01)；與42 ℃熱應激組相比，42℃+Pue組HSP70蛋白表達也顯著(P<0.05)增加(圖4)。

圖4 葛根素對SCs中HSP70蛋白表達的影響

3 討論

機體內自由基不斷產生并不斷被清除，一旦出現應激源，機體可產生大量的自由基[6]。研究發現，熱應激可使豬睪丸細胞產生活性氧(ROS)，并使生殖細胞脂質發生過氧化反應[2]，當過氧化反應超過抗氧化能力，則誘導產生氧化應激，產生脂類過氧化物，尤其是丙二醛，其過多產生會影響精子運動能力和受精能力[7]。生物體內主要的抗氧化酶有超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶。本研究發現熱應激后SCs細胞存活率顯著降低，這可能與MDA含量增加以及細胞凋亡有關，SCs細胞受熱應激后，細胞核皺縮濃染，凋亡率增加，同時抗氧化酶含量降低，說明熱應激使牛睪丸支持細胞產生氧化應激損傷。

近年來研究葛根素具有較強的抗氧化作用，可降低細胞脂質過氧化作用。提高細胞清除超氧陰離子的能力，從而發揮抗自由基損傷的作用[8]。葛根素可以增強心室乳頭肌內SOD活性，降低MDA含量，通過清除自由基減輕脂質過氧化反應，起到保護細胞作用[9]。此外，HSP70是細胞受到應激后產生的蛋白質，具有抗氧化，對過氧化氫所致乳鼠心肌細胞核仁損傷具有保護作用[10]。研究發現，心肌缺血再灌注后葛根素能夠顯著上調HSP70表達，抑制血清中過氧化物酶(MPO)活性，保護心肌。本研究表明一定濃度葛根素可顯著提高熱應激細胞后SOD、GSH-Px和CAT活力，極顯著降低MDA含量，且與維生素E具有同樣的抗氧化效果。同時葛根素提高熱應激處理SCs的HSP70蛋白表達，可以推斷葛根素對SCs的抗氧化損傷能力可能與HSP70的分子伴侶作用有關。

綜上所述，熱應激能使牛睪丸支持細胞產生氧化損傷，而葛根素可以有效緩解熱應激所致的氧化應激損傷，且其作用機制與葛根素能增加熱應激狀態下細胞抗氧化酶活性以及增加HSP70的表達有關。然而，葛根素的抗氧化作用機制以及在體內葛根素是否有和在體外同樣的作用，還有待進一步深入研究。

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Protective Effect of Puerarin on Heat Stress-inducedOxidative Damage in Bovine Sertoli Cells

CONG Xia1, ZHANG Dong-jun2, REN Ting-ting1, ZHANG Qian1, ZHU Li-ping1, LI Qi1,CAO Rong-feng1, TIAN Wen-ru1, LI Hua-tao1

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109,China; 2.Veterinary and Animal Husbandry Department Feicheng, Feicheng 271600, China)

Puerarin(Pue)is a flavonoid extracted from traditional Chinese medicine Puerarin with obvious antioxidant effect. Whether Pue has the protective effect of Bovine Sertoil cells (SCs) on heat stress is still unclear. The cells were incubated with or without various concentrations of Pue, and then heat-stressed at 42℃ for 1 h and returned to 34℃ for 6h. Cell viability was decreased, and the apoptosis rate was increased and the cellular oxidative damage occurred after heat stress. However, the MDA content in the SCs treated with heat stress decreased significantly after Pue pretreatment.Also, the SOD, CAT and GSH-Px activities were significantly increased compared to heat stress group. There was no significant difference in the parameters determined above between Pue and VE pretreatment groups. Furthermore, Western-blot results showed that Pue significantly enhanced the expression of HSP70. Pue protects SCs from heat stress induced oxidative damage possibly by increasing activities of antioxidative enzymes and increased HSP70 expression.

Bovine Sertoli Cells; Puerarin; Heat stress; HSP70; Antioxidant enzyme activity

LI Hua-tao

2015-08-03

國家自然科學基金 (31572590, 31502138)；山東省自然科學基金(BS2015NY001)；山東省高等學校科技計劃項目(J15LF03)

叢霞(1962- )，女，高級實驗師,碩士，主要從事動物生殖與生殖疾病研究，E-mail: wrtian@126.com

李華濤，E-mail: htli1986@hotmail.com

R285

A

0529-6005(2016)11-0043-03