自擬中藥復方對免疫抑制小鼠免疫功能的影響

邱 妍 ， 董發明 , 楊國棟 ， 林 霖

(河南科技大學動物科技學院 ， 河南洛陽471003)

自擬中藥復方對免疫抑制小鼠免疫功能的影響

邱 妍 ， 董發明 , 楊國棟 ， 林 霖

(河南科技大學動物科技學院 ， 河南洛陽471003)

為探討自擬中藥復方對免疫抑制小鼠的免疫調節作用，將女貞子、菟絲子、熟地、蒲公英、甘草按一定比例配伍，制備水煎液(質量濃度為1 g/mL)。將80只昆明系小鼠隨機分為5組(空白對照組、免疫抑制模型組和中藥復方高、中、低劑量組)，空白對照組和免疫抑制模型組小鼠灌服蒸餾水(0.2 mL/只)，復方高、中、低劑量組小鼠分別灌服300 mg/只、200 mg/只、100 mg/只的復方水煎液，連續14 d。除空白對照組外，其他各組小鼠于給藥的第1、3、5、7天皮下注射地塞米松(30 mg/kg體重)。試驗第20天，將所有小鼠進行眼球采血，剖殺，稱量體質量、胸腺重、脾臟重，計算胸腺、脾臟指數；分離血清，測定血清中免疫球蛋白G(IgG)、溶菌酶、白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素4(IL-4)和干擾素γ(INF-γ)的含量。結果顯示，與免疫抑制模型組相比，復方中劑量組能夠顯著增加小鼠的胸腺和脾臟指數，提高小鼠血清中IgG、溶菌酶、IL-2、INF-γ的含量；而對IL-4含量無顯著影響。可以得出：自擬復方水提液能夠明顯改善免疫抑制小鼠的免疫功能，且這種調節作用與給藥劑量有一定相關性。

中藥 ； 小鼠 ； 免疫器官指數 ； IgG ； 溶菌酶 ； 細胞因子

近年來，在我國畜牧業生產中，畜禽免疫抑制正逐漸成為養殖場最為普遍的頭號養殖難題，一些免疫抑制病，如豬的藍耳病、圓環病毒病，禽的馬立克病、傳染性腔上囊病等，在養殖生產中流行較廣，對畜牧業的影響相當嚴重。防治這類疫病的根本原則是使動物機體較低的免疫功能恢復，提高機體免疫力。目前有很多關于免疫增強劑的研究，其中中藥類免疫增強劑，因其來源廣泛、安全性高和調節機體陰陽平衡，符合無公害健康養殖的趨勢，成為研究熱點之一[1]。近些年,中藥提取物是研究較多的中藥類免疫增強劑，然而批量生產中藥提取物相對繁瑣，生產代價較高，很難在畜禽養殖中推廣應用。中藥復方是協同作用的基礎，有利于發揮中藥配伍的優勢，生產工藝簡單，更適合應用于畜牧生產。本試驗選擇了幾種具有一定的免疫調節作用的中藥：女貞子、菟絲子、熟地、蒲公英、和甘草[2-6]，配伍組成復方，所選中藥具有調補陰陽，清熱散癰的作用，且常見、廉價，能夠降低用藥成本。本試驗擬通過觀察不同劑量的復方水提液對免疫抑制小鼠幾項免疫指標的影響，初步評價此自擬復方對免疫抑制小鼠免疫功能的調節作用，從而為進一步研究此中藥復方對畜禽的免疫調節作用提供理論數據。

1 材料與方法

1.1 供試動物 昆明系小鼠80只，雌雄各半，體質量為18±2 g。購自鄭州大學實驗動物中心。

1.2 中藥和主要試劑 女貞子、菟絲子、熟地、蒲公英、甘草，購自張仲景大藥房；地塞米松注射液(吉林敖東藥業生產)；小鼠免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒，小鼠溶菌酶試劑盒，購自上海勁馬生物有限公司；小鼠白細胞介素2(IL-2)ELISA試劑盒，小鼠白細胞介素4(IL-4)ELISA試劑盒，小鼠γ干擾素(INF -γ)ELISA試劑盒，購自上海邦奕商貿公司。

1.3 中藥復方水煎液的制備 女貞子30 g、菟絲子20 g、熟地20 g、蒲公英30 g、甘草20 g，加水適量，浸泡1 h后煮沸，改用文火煎30 min，濾出煎液，藥渣再加水煎煮，過濾，合并兩次濾液，濃縮至每1 mL藥液含生藥1 g(1 g/mL)，備用。

1.4 試驗動物的分組及處理 購回的小鼠在安靜、清潔的條件下飼養，給予潔凈營養飼料，先飼喂5-7 d以使其適應。將80只昆明系小鼠隨機分為5組，每組16只(雌雄各半且分籠飼養，每籠8只)，分別為空白對照組、免疫抑制模型組和中藥復方高、中、低劑量組。空白對照組和免疫抑制模型組小鼠灌服蒸餾水(0.2 mL/只)，復方高中低劑量組小鼠分別灌服不同劑量的復方水煎液，劑量為300 mg/只、200 mg/只、100 mg/只，連續14 d。除空白對照組皮下注射生理鹽水外，其他各組小鼠于給藥的第1,3,5,7天皮下注射地塞米松(40 mg/kg)。

1.5 小鼠體質量、胸腺指數與脾臟指數的測定 各組小鼠采血后處死，稱取體質量，解剖小鼠，取其脾臟、胸腺，用吸水紙浸干表面血液，稱重，記錄。計算小鼠胸腺、脾臟指數：胸腺指數=胸腺質量/小鼠體質量(mg/g)，脾臟指數=脾臟質量/小鼠體質量(mg/g)。

1.6 小鼠血清中免疫球蛋白G(IgG)、溶菌酶含量的測定 試驗第20天，對各組小鼠進行眼球采血。血液靜置待凝固，2500 r/min離心5 min，分離血清，備用。按照說明書步驟操作，根據標準曲線計算含量。

1.7 小鼠血清中IL-2、IL-4、INF -γ含量的測定 按照說明書步驟操作，根據標準曲線計算含量。

1.8 數據處理 數據以Means ±SD表示，并用SPSS軟件進行Duncan′分析，判斷結果差異是否顯著。

2 結果與分析

2.1 自擬復方對小鼠體質量、胸腺指數與脾臟指數的影響 本試驗測定了自擬復方對免疫抑制小鼠體質量、脾臟指數和胸腺指數的影響，結果顯示，復方高、中、低劑量組小鼠的體質量顯著高于模型組(P<0.05)，中劑量組小鼠的平均體質量比模型組高3.03 g；復方高、中劑量組的脾臟指數顯著高于模型組(P<0.05)，與空白對照組無顯著差異(P>0.05)中劑量組小鼠的脾臟指數比模型組高0.47；復方高、中、低劑量組的胸腺指數均顯著高于模型組(P<0.05)，高劑量組小鼠的胸腺指數比模型組高0.63，但復方組都顯著低于空白對照組(P<0.05)。可見中劑量的復方可以提高免疫抑制小鼠的體質量和脾臟指數，使其接近正常小鼠的水平；對胸腺指數也有一定的提高，但仍顯著低于正常小鼠(見表1)。

表1 自擬復方對小鼠體質量、胸腺指數、脾臟指數的影響

注：同行數據中肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下表同

2.2 自擬復方對小鼠血清中IgG含量及溶菌酶含量的影響 本試驗用ELISA法測定了各組小鼠血清中IgG和溶菌酶的含量。結果顯示，復方高、中、低劑量組小鼠血清中的IgG含量均明顯高于模型組(P<0.05)，復方中劑量組小鼠的IgG含量比模型組高41.79 ng/mL，且與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；復方中、低劑量組小鼠血清中溶菌酶含量均明顯高于模型組(P<0.05)，中劑量組小鼠的溶菌酶含量比模型組高0.87 ng/mL，且與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。可見中劑量的復方可以提高免疫抑制小鼠血清中的IgG和溶菌酶的含量，使其接近正常小鼠的水平(見表2)。

表2 自擬復方對小鼠血清中IgG和溶菌酶含量的影響

2.3 自擬復方對小鼠血清中IL-2、IL-4、INF-γ含量的影響 本試驗采用ELISA法測定了各組小鼠血清中IL-2、IL-4、INF-γ的含量。復方高、中、低劑量組小鼠血清中IL-2含量顯著高于模型組(P<0.05)，中劑量組比模型組高8.27 pg/mL，與空白對照組差異不顯著(P>0.05)；復方高、中、低劑量組小鼠血清中IL-4含量低于模型組，但差異不顯著(P>0.05)，與空白對照組差異也不顯著(P>0.05)； 復方高、中劑量組小鼠血清中INF-γ含量顯著高于模型組(P<0.05)，中劑量組比模型組高6.23 pg/mL，與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。可見中劑量的復方可以提高免疫抑制小鼠血清中IL-2、INF-γ的含量，使其接近正常小鼠的水平，但是對IL-4無顯著影響(見表3)。

表3 自擬復方對小鼠血清中幾種細胞因子含量的影響

3 討論

3.1 自擬復方對小鼠免疫器官指數的影響 脾臟和胸腺是機體中重要的淋巴器官，兩者的功能與機體免疫狀況緊密相關。免疫器官指數是衡量機體免疫狀態的初步指標。在本試驗中，注射地塞米松的小鼠體質量、脾臟和胸腺指數均顯著低于正常小鼠，尤其以胸腺萎縮最為嚴重。灌服自擬復方后可以提高免疫抑制小鼠的體質量及免疫器官指數，其中復方中劑量組的體質量、脾臟指數和對照組小鼠相近，差異不顯著。但是胸腺萎縮嚴重，灌服中藥復方后，小鼠的胸腺也未能恢復到空白對照組小鼠的水平。有報道[7]杜仲葉多糖可以顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺指數，且達到正常小鼠的水平。與本試驗結果不一致。但Ahmed S A曾報道[8]，糖皮質激素對免疫系統有明顯的抑制作用，并且以胸腺的細胞凋亡最為明顯，正常組織被破壞，且恢復較慢。可以解釋本試驗中為何脾臟指數基本恢復到正常水平，而胸腺指數未能恢復到正常。本試驗證明了自擬復方對地塞米松引起的小鼠胸腺和脾臟萎縮具有一定的抵抗作用，從而間接的改善免疫抑制小鼠的免疫功能。

3.2 自擬復方對小鼠血清中IgG和溶菌酶的影響 IgG是血清主要的抗體成分，約占血清免疫球蛋白總量的75%。主要是機體體液免疫應答中產生的。溶菌酶來自單核細胞、嗜中性粒細胞，能溶解某些細菌，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。本試驗結果顯示，自擬復方高中低劑量均可以提高免疫抑制小鼠血清中IgG和溶菌酶含量，其中復方中劑量組與空白對照組小鼠的IgG含量相近，差異不顯著。免疫小鼠血清中IgG和溶菌酶含量的增加可以在一定程度上反映小鼠機體免疫能力的提高，合適劑量的自擬復方水提液可以使免疫抑制小鼠血清中免疫球蛋白和溶菌酶基本恢復到正常水平，進而改善小鼠的免疫狀況。

3.3 自擬復方對小鼠血清中幾種細胞因子含量的影響 細胞因子能介導和調節免疫應答，檢測細胞因子水平可以反映機體的免疫狀態。IL-2 主要由TH1 細胞分泌，參與細胞免疫反應; IL-4 主要由TH2 細胞分泌，參與體液免疫反應。IFN-γ主要由活化的Th1 細胞和NK 細胞所產生，并通過增強Th1 細胞活性而提高細胞免疫功能。本試驗結果顯示，中劑量的自擬中藥復方可顯著增加免疫抑制小鼠血清中IL-2、IFN-γ含量，使其基本達到空白對照組健康小鼠的水平。表明自擬復方對免疫抑制小鼠的免疫功能具有一定的調節作用。盧舜飛等[9]也報道，剎毒草合劑可通過提高免疫抑制小鼠血清中IL-2、TNF-α及IFN-γ的濃度而發揮免疫調節作用。在本試驗中地塞米松使小鼠血清中IL-4的含量升高，自擬復方使免疫抑制小鼠血清中IL-4的含量降低，但差異不顯著，中藥組與空白對照組差異也不顯著。高光平等[10]試驗證明，紫黃散和扶正解毒散均能明顯提高免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4 和IFN-γ 水平，與本試驗結果不一致。也有報道[11]免疫抑制劑升高小鼠脾細胞中IL-4，中藥歸參湯可以降低IL-4水平，與本試驗結果有一定的相似性。推測免疫抑制劑對機體IL-4的影響存在不確定性，但是最終機體內IL-2、IL-4的含量變化要使TH1/TH2達到一定平衡，具體調節機制還有待研究。

綜上所述，自擬中藥復方能夠改善免疫抑制小鼠的免疫功能，且這種增強作用與中藥復方的用藥劑量有一定相關性。本試驗結果可以為進一步的研究提供理論參考。

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The Effects of Self-made Chinese Medicine Compound on Immune Function of Immunosuppressive Mice

QIU Yan, DONG Fa-ming, YANG Guo-dong， LIN Lin

(College of Animal technology, Henan Science and Technology University, Luoyang 471003, China)

In order to investigate the immune regulation effect of a Chinese herbal compound by our own formulation on immune suppression mice,we selected Ligustrum lucidum,dodder seed,radix rehmanniae, dandelion and licorice,which were prepared for water decoction(concentration of 1g/ml) according to a certain proportion.Eighty Kunming rats were randomly divided into 5 groups:control group,immune suppression model group and traditional Chinese medicine compound group with high,medium and low doss.The mice of control group and immune suppression model group were administrated with distilled water (each 0.2ml).Each mouse from Chinese medicine compound with high, medium or low dose group was given different doses of the water decoction(300 mg, 200 mg and 100 mg,respectively)for 14 consecutive days.The mice except control group were injected with dexamethasone (30mg/kg) subcutaneously,at the 1st,3rd,5th,and 7th day after being given the water decoction.Blood was gained from the eyeballs of mice on the 20th day of the experiment,and then the mice were killed and body weight, thymus gland weight and spleen weight,were weighed and thymus index and spleen index were calculated.The content of serum immune globulin protein G (IgG), lysozyme, leukocyte mediated IL 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4) and interferon gamma (INF gamma) were determined after the serum separation.The experiment results showed that compared with the immune suppression model group,the Chinese medicine compound group of medium dose significantly increased the thymus and spleen index of mice, increased the content of serum IgG, lysozyme, IL-2, IFN gamma,but no significant effect on the content of IL-4.In conclusion,the Chinese herbal compound water extract by our own formulation can obviously improve the immune function of the immune suppression mice,and there is a certain correlation with the dose.

self-made Chinese medicine compound , mice , the index of immune organ , IgG , Lysozyme , cytokine

2015-08-18

河南科技大學博士啟動基金(09001240)

邱妍 (1980-)，女，副教授，博士，主要從事中獸藥相關研究，E-mail：qiuyan135@sina.com

S853.7

A

0529-6005(2016)11-0070-04