多奈哌齊抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型血腦屏障滲透性的研究

江瀅 劉瑩瑩 馬麗麗 陳曉紅

·基礎研究論著·

多奈哌齊抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型血腦屏障滲透性的研究

江瀅 劉瑩瑩 馬麗麗 陳曉紅

目的 探討多奈哌齊對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型血腦屏障滲透性的影響。方法 將48只6～8周齡雌性C57BL/6小鼠分為多奈哌齊組(19只)、PBS 組(19只)與空白對照組(10只)。將多奈哌齊組及PBS組制備為EAE小鼠模型，在接種免疫后第13日，將多奈哌齊2 mg/(kg·d)溶解于PBS中對多奈哌齊組進行灌胃；而PBS組只予PBS進行灌胃。對EAE小鼠進行臨床癥狀評分和組織學評估(炎癥評分及脫髓鞘評分)，利用伊文思藍對EAE小鼠腦組織的藍染程度評估血腦屏障滲透性，用蛋白免疫印跡法檢測EAE小鼠腦組織中基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達情況。結果 多奈哌齊組的臨床癥狀評分低于PBS組的臨床癥狀評分 (t=4.351,P<0.001)。多奈哌齊組的炎癥評分低于PBS組(t=6.325,P<0.001)；PBS組的腰髓有大片的髓鞘脫失，但多奈哌齊組脫髓鞘病變較其少，2組評分比較差異有統計學意義(t=3.308,P=0.008)。與空白對照組相比，PBS組(t=8.621,P<0.001)和多奈哌齊組(t=9.974,P<0.001)腦內伊文思藍含量均較高；與PBS組相比，多奈哌齊組腦內伊文思藍含量較低(t=2.286,P=0.045)。與PBS組相比，多奈哌齊可抑制MMP-2(t=4.679,P=0.010)和MMP-9 (t=5.822,P=0.001)的表達。結論 多奈哌齊可降低EAE小鼠血腦屏障的滲透性。

多奈哌齊；實驗性自身免疫性腦脊髓炎；血腦屏障；基質金屬蛋白酶

多發性硬化(MS)是最常見的發生于青年人的中樞神經慢性炎性脫髓鞘疾病[1]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠是研究MS免疫病理學機制及其實驗治療的最佳動物模型[2]。研究顯示，EAE的特征性病理變化是血腦屏障破壞和T細胞進入中樞神經系統，導致腦內細胞因子、基質金屬蛋白酶(MMP)和自由基的含量升高，最終導致髓鞘脫失和神經傳導受阻[1,3]。多奈哌齊是一種具有高選擇性的膽堿酯酶抑制劑，可用于阿爾茨海默病的治療，且目前發現其具有抗炎效應及神經保護作用[4-7]。雖然多奈哌齊已經被用于治療MS患者和EAE小鼠的認知功能障礙，但其在EAE/MS中的抗炎作用目前尚未清楚[8-10]。在本研究中，我們探討了多奈哌齊對EAE小鼠模型的血腦屏障滲透性及MMP-2/9的影響，現將結果報告如下。

材料與方法

一、動物和試劑

6～8周齡雌性C57BL/6小鼠(體質量16～18 g)48只，購自中山大學動物實驗中心。將小鼠分為多奈哌齊組19只(其中7只用于臨床癥狀評估、6只用于組織學評估及MMP-2/9蛋白免疫印跡測定、6只用于血腦屏障受損的評價)，PBS 組19只(只數分配與多奈哌齊組相同)與空白對照組10只(其中6只作為血腦屏障受損的評價對照、4只作為MMP-2/9蛋白免疫印跡測定對照)。多奈哌齊和完全弗氏佐劑(CFA)購自Sigma公司。MOG35-55(MEVGWYRSP FSRVVHLYRNGK)肽段由CL.BioScientific公司合成(中國西安)。純度超過95%的結核分支桿菌H37Ra購自Difco公司，百日咳毒素(PTX)購自Alexis公司。單克隆MMP-2抗體和多克隆MMP-9抗體分別購自Thermo Fisher Scientific公司和Abcam公司。

二、EAE小鼠模型的誘導和臨床癥狀評估

采用經典的MOG35-55肽段免疫誘導方法將多奈哌齊組及PBS組制備為EAE小鼠模型[11]。首先，將200 μg MOG35-55肽段乳化于含結核分支桿菌H37RA 500 μg的完全弗氏劑中，并對2組小鼠皮下注射混合后的完全弗氏劑，同時腹腔注射含PTX 300 ng的PBS，并在48 h后腹腔注射相同劑量的PTX，在第7日追加皮下注射含MOG35-55肽段的完全弗氏劑。在接種免疫后第13日，將多奈哌齊2 mg/(kg·d)(此劑量的選擇來源于已發表文章的數據和尋找最佳劑量的預實驗)溶解于PBS中對多奈哌齊組進行灌胃[8]；而PBS組只予PBS進行灌胃。每日評估EAE小鼠的殘疾程度，臨床癥狀評分標準如下：0分，無標志；1分，尾部張力減退；2分，松弛尾；3分，后肢共濟失調和(或)輕癱； 4分，后肢完全癱瘓；5分，垂死或死亡[11]。在我們的實驗中，我們定義個體小鼠出現第一種癥狀的時間為疾病的發病時間，臨床癥狀評分的均值為在實驗中每只小鼠的臨床癥狀評分總和的平均值。臨床癥狀評分越高，個體小鼠的病情越重。

三、組織學評估

應用常規蘇木素-伊紅(HE)染色和依來鉻花青浸漬染色對EAE小鼠腰髓組織分別進行炎性浸潤和脫髓鞘評估。炎癥評分量表如下所示：0分，沒有炎性細胞；1分，一些散在的炎性細胞；2分，炎性細胞浸潤在血管周圍；3分，廣泛血管周圍袖套帶形成并擴展到相鄰實質，或實質浸潤無明顯的袖套[12]。腰髓的脫髓鞘情況據文獻[13]報導的評分細則進行評分：1分，軟腦膜下脫髓鞘；2分，軟腦膜下及血管周圍發生明顯的脫髓鞘；3分，血管周圍或軟膜下脫髓鞘發生融合；4分，血管周和軟腦膜下脫髓鞘，并累及一個半腰髓，伴隨著大量細胞侵入中樞神經系統實質；5分，血管周和軟腦膜下脫髓鞘，并累及整個腰髓，伴隨著大量細胞侵入中樞神經系統實質。

四、血腦屏障受損的評價

我們用伊文思藍染色評估空白對照組、PBS組和多奈哌齊組血腦屏障的完整性[14]。2%伊文思藍染色劑均經過滅菌消毒。在小鼠接種免疫后第20日，每只小鼠靜脈接受的伊文思藍劑量為4 ml/kg。靜脈注射伊文思藍30 min后，伊文思藍染色液向全身組織擴散，用生理鹽水沖洗掉血管內的伊文思藍染色液。迅速取出小鼠腦組織并稱重，用2.5 ml PBS和2.5 ml 60%的三氯乙酸混合液浸泡腦組織，以達到沉淀蛋白質的目的。樣品在1 000×g的離心力下離心30 min。取上清液，用分光光度計在610 nm波長下測量EAE小鼠腦內的伊文思藍含量(EB的吸光度)。根據伊文思藍的溶液標準曲線計算其含量。

五、MMP-2/9蛋白免疫印跡測定

MMP(尤其是MMP-2/9)可以增加EAE小鼠和MS患者的血腦屏障滲透性，我們用蛋白免疫印跡法檢測空白對照組、PBS組和多奈哌齊組腦內的MMP-2和MMP-9的表達。各組小鼠腦組織均用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(每孔含有20 μg)進行電泳，然后把所分離的蛋白轉移至PVDF膜(Bio-Rad)，并用5%的脫脂奶粉封閉，接著分別加入多克隆抗MMP-2抗體(1∶2 000)和多克隆抗MMP-9抗體(1∶2 000)在4℃搖育過夜。在TBST緩沖液洗膜3次后，分別加入辣根過氧化物酶標記的鼠抗體和兔抗體孵育30 min。整個實驗重復3次，選擇-actin作為內參。最后將所得譜帶照相并經Quantity one圖像分析軟件分析相應譜帶密度值，結果以譜帶的光密度值和空白地方(沒有譜帶部位)光密度值的比值表示。

六、統計學處理

結 果

一、多奈哌齊對EAE小鼠臨床癥狀嚴重程度的影響

PBS組與多奈哌齊組的發病時間無明顯差異[(14.0±0.3)dvs.(14.7±0.2)d,t=1.987,P=0.070]。多奈哌齊組的臨床癥狀評分為(1.08±0.13)分，而PBS組的臨床癥狀評分為(2.05±0.18)分，比較差異有統計學意義 (t=4.351,P<0.001)。

二、多奈哌齊對EAE小鼠病理結果的影響

多奈哌齊組的炎癥評分明顯低于PBS組[(1.50±0.18)分vs.(2.83±0.11)分,t=6.325,P<0.001]。此外，在接種免疫后第20日，我們發現PBS組的腰髓有大片的髓鞘脫失，但多奈哌齊組脫髓鞘病變較其少，2組評分比較差異有統計學意義[(1.92±0.20)分vs.(2.67±0.12)分,t=3.308,P=0.008]。2組典型炎癥病變和脫髓鞘病變的切片如圖1所示。

三、多奈哌齊對EAE小鼠血腦屏障的影響

空白對照組、PBS組和多奈哌齊組腦內伊文思藍含量分別為(67.2±3.2)mg/g、(185.8±13.4) mg/g與(150.5±7.7)mg/g。與空白對照組相比，PBS組(t=8.621,P<0.001)和多奈哌齊組(t=9.974,P<0.001)小鼠腦內伊文思藍含量均較高。但與PBS組相比，多奈哌齊組腦內伊文思藍含量較低(t=2.286,P=0.045)。

四、多奈哌齊對EAE小鼠腦內MMP-2和MMP-9表達的影響

與空白對照組相比，PBS組MMP-2 (5.60±0.65vs. 0.54±0.25,t=7.286,P=0.002)和MMP-9 (10.93±0.87vs. 2.61±0.49,t=8.322,P<0.001)的表達更高，而與PBS組比較，多奈哌齊可以抑制EAE小鼠腦內MMP-2 (1.95±0.44vs. 5.60±0.65，t=4.679,P=0.010)和MMP-9 (4.45±0.70vs. 10.93±0.87,t=5.822,P=0.001)的表達，見圖2。

討 論

據文獻報道，多奈哌齊可以改善MS患者和EAE小鼠的認知功能[8-10，15-16]。在本研究中，我們觀察到多奈哌齊可以減輕EAE小鼠病情的嚴重程度及其腰椎細胞浸潤和脫髓鞘征象，這恰恰與PBS組截然相反，近期也有研究顯示多奈哌齊可以快速增加調節少突膠質細胞分化及髓鞘化的髓鞘相關基因的轉錄水平[17]。以上結果表明多奈哌齊對于疾病臨床期的EAE小鼠是具有治療作用的。

多奈哌齊發揮抗炎作用的潛在機制是多因素的。De Vries等[18]發現，血腦屏障滲透性升高，導致大量的白細胞進入中樞神經系統，這一病理變化在MS和EAE小鼠疾病的發生和進展中扮演著重要角色。MMP-2和MMP-9可能與T細胞遷移進入中樞神經系統和血腦屏障破壞相關，它們可以特異性降解Ⅳ型膠原，Ⅳ型膠原是血管基底膜的一個核心結構成分，其降解會導致血腦屏障的破壞[19- 22]。在EAE小鼠出現臨床癥狀時，MMP-2和MMP-9的表達達到高峰，在MS患者的腦組織中也存在相同現象[23-25]。在本研究中，我們發現血腦屏障滲透性的升高與MMP-2和MMP-9的上調同時存在，即多奈哌齊能降低MMP的表達和血腦屏障的滲透性[26]。

圖1 多奈哌齊組和PBS組腰髓組織病理結果

A、a：PBS組HE染色切片，可見普遍存在著炎性浸潤與廣泛的血管袖套形，A為×40， a為×400；B、b：多奈哌齊組HE染色切片，炎性浸潤與血管袖套形成較PBS組少，B為×40，b為×400；C、c：PBS組依來鉻花青浸漬染色切片，可見大片的脫髓鞘斑塊形成，C為×40，c為×400；D、d：多奈哌齊組依來鉻花青浸漬染色切片，脫髓鞘斑塊較PBS組少，D為×40，d為×400

圖2 不同組小鼠腦內MMP-2和MMP-9的表達情況

與空白對照(control)組相比，**P<0.01，與PBS組比較，##P<0.01

目前，多奈哌齊已被用于治療EAE小鼠及MS患者的認知功能障礙[8-10]。我們的研究進一步表明多奈哌齊可以減輕EAE小鼠疾病的嚴重程度、降低EAE小鼠中血腦屏障的滲透性及MMP-2/9的表達，提示在疾病臨床期予以多奈哌齊可以減輕EAE小鼠炎癥及炎癥介導的一系列病理生理反應，而通過抑制MMP-2/9的表達改善血腦屏障滲透性的效應可能是多奈哌齊治療EAE的一個機制，提示多奈哌齊在MS的治療上具有應用前景。

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(本文編輯：洪悅民)

Effect of donepezil on inhibiting blood-brain barrier permeability in mouse models with experimental autoimmune encephalomyelitis

JiangYing,LiuYingying,MaLili,ChenXiaohong.

DepartmentofNeurology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

,ChenXiaohong,E-mail:xiaohongchenzssy@aliyun.com

Objective To evaluate the effect of donepezil upon inhibiting the blood-brain barrier permeability in mouse models with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Methods Forty eight female C57BL/6 mice, aged 6-8 weeks, were divided into the donepezil (n=19), phosphate buffer saline(PBS,n=19) and control groups (n=10). EAE mouse models were established in the donepezil and PBS groups. In the donepezil group, intragastric gavage of PBS containing 2 mg/(kg·d) of donepezil was delivered at 13 d after innoculation, whereas PBS alone was administered in the PBS group. The grading of clinical symptoms and histological evaluation were performed in EAE mice (inflammation and demyelinating scores). The blood-brain barrier permeability was assessed by Evans blue staining. The expression levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and MMP-9 were measured by western blot. Results The score of clinical symptoms in the donepezil group was significantly lower compared with that in the PBS group (t=4.351,P<0.001). The inflammation score in the donepezil group was considerably lower than that in the PBS group (t=6.325,P<0.001). In the PBS group, a large mass of myelinoclasis was observed, whereas demyelinating lesion was seldom seen in the donepezil group with statistical significance (t=3.308,P=0.008). Compared with the control group, intracerebral content of Evans blue in the PBS (t=8.621,P<0.001) and donepezil groups (t=9.974,P<0.001) was significantly higher. However, intracerebral content of Evans blue in the donepezil group was significantly less compared with that in the PBS group (t=2.286,P=0.045). Compared with the PBS group, donepezil could significantly down-regulate the expression levels of MMP-2 (t=4.679,P=0.010) and MMP-9 (t=5.822,P=0.001). Conclusion Donepezil can reduce the blood-brain barrier permeability in EAE mouse models.

Donepezil; Experimental autoimmune encephalomyelitis; Blood-brain barrier; Matrix metalloproteinase

10.3969/j.issn.0253.9802.2016.12.003

廣東省醫學科研基金(A2014233)

510630 廣州，中山大學附屬第三醫院神經病學科

，陳曉紅，E-mail：xiaohongchenzssy@aliyun.com

2016-08-23)