肝星狀細胞對肝癌細胞株MHCC-LM3上皮間質轉化的影響

李博 馬俊 賀歡 王麗萍 許鳴

·基礎研究論著·

肝星狀細胞對肝癌細胞株MHCC-LM3上皮間質轉化的影響

李博 馬俊 賀歡 王麗萍 許鳴

目的 探討肝星狀細胞LX-2對肝癌細胞株MHCC-LM3上皮間質轉化(EMT)的影響。方法 制備肝星狀細胞LX-2上清，用LX-2上清和MHCC-LM3共培養(實驗組)，以單獨培養的MHCC-LM3為對照(對照組)，比較2組的肝癌細胞形態學、侵襲能力、EMT相關的上皮標記物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及間質標記物波形蛋白Vimentin蛋白表達的變化。結果 與對照組相比，實驗組的肝癌細胞MHCC-LM3形態拉長，細胞間連接變得疏松。Transwell實驗顯示，實驗組在共培養12、24、48 h的侵襲細胞數均比對照組增多(P均<0.01)；隨著培養時間的延長，實驗組的侵襲細胞也隨之增多(P均<0.01)。實驗組MHCC-LM3細胞在共培養24、48 h時的E-cadherin蛋白表達水平均低于對照組細胞(P均<0.01)，在共培養12、24、48 h時的Vimentin蛋白表達水平均高于對照組(P均<0.01)。結論 肝星狀細胞能夠促進肝癌細胞株MHCC-LM3的EMT過程，增強其侵襲能力。

肝癌；肝星狀細胞；上皮間質轉化

我國肝癌的病死率在所有惡性腫瘤中僅次于胃癌、肺癌，位列第三。肝癌的遠期療效不佳，轉移率非常高，因而研究肝癌的發病、轉移機制對改善其預后有著重要意義。肝癌的發生和轉移不僅與其所在組織的結構、代謝和功能有關，還與肝癌細胞所處的微環境，即癌細胞、細胞因子、多種基質細胞、趨化因子等組成的微環境有關[1]。肝星狀細胞是肝癌微環境的重要間質細胞，活化的肝星狀細胞能夠分泌多種細胞因子影響肝癌細胞微環境，促進肝癌的發生和發展[2]。本研究通過建立體外永生化人肝星狀細胞株LX-2上清與人肝癌細胞株MHCC-LM3的共培養模型, 觀察共培養后MHCC-LM3細胞的形態轉變以及MHCC-LM3侵襲能力及其上皮間質轉化(EMT)相關標記物的表達變化，初步探討肝星狀細胞對肝癌細胞株MHCC-LM3 EMT的影響。

材料與方法

一、材 料

人肝星狀細胞LX-2、人肝癌細胞株MHCC-LM3購自上海中科院細胞研究所。高糖 DMEM 培養基、胰酶消化液購自美國Gibco 公司，Transwell小室購自美國Coming 公司，胎牛血清購自杭州四季清生物公司；Matrigel 生物膠購自美國BD 公司；鼠抗人E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)單克隆抗體、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體及內參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)購自南京凱基公司。

二、方 法

1. 細胞培養及肝星狀細胞上清制備

肝癌細胞株MHCC-LM3在37 ℃、5%CO2條件下，用10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養, 細胞長滿單層后用胰蛋白酶消化傳代。肝星狀細胞LX-2以含10%胎牛血清的DMEM培養基培養至80%滿度，換無血清的培養基繼續培養48 h，以10 000×g 離心10 min，收集上清，-80 ℃凍存待用。

2. 細胞形態學觀察

收集對數期細胞，將MHCC-LM3細胞調至1×108/L，以DMEM培養基接種于96孔板中，每孔200 μl, 培養至約80%滿度, 換成無血清的DMEM培養基，繼續培養18 h, 實驗組加入上述制備的200 ml LX-2上清，分別繼續培養12、24、48 h，對照組用無血清培養基分別繼續培養12、24、48 h，到時間點后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態學變化。

3. Transwell侵襲試驗

將基底膜鋪在Transwell膜上, 37 ℃包被聚合，加入含牛血清白蛋白的無血清培養基，置37 ℃ 30 min。在Transwell上室加入MHCC-LM3，實驗組下室加入2 ml LX-2上清，對照組為下室加入的無血清培養液，分別培養12、24、48 h，到時間點后，取出小室，用棉簽擦掉小室上室面的細胞及基質膠，于95%乙醇中固定15 min，3%結晶紫染色30 min。將小室放于倒置顯微鏡下，200 倍放大倍數下隨機觀察細胞侵襲情況，每個樣本隨機取10 個視野(放大倍數 200倍)拍照，計數侵襲至小室下層的細胞，取平均值。每組重復3次。

4. 蛋白免疫印跡法

收集各組細胞，加入600 μl RIPA細胞裂解液，置冰上30 min后，離心30 min，上清即為總的細胞蛋白溶解成分。上清加等量2倍十二烷基磺酸鈉(SDS)上樣緩沖液在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后電轉膜到醋酸纖維膜上，用50 g/L脫脂奶粉封閉，分別加入相應一抗(E-Cadherin、Vimentin抗體)，4℃孵育過夜，Tris-HCl緩沖液洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1∶10 000)在37℃孵育2 h，常規洗膜3次，增強化學發光(ECL)熒光顯色系統檢測，X線片感光顯影，AlphaImager 2200圖像系統分析灰度值。每組重復3次。

三、統計學處理

結 果

1. 肝星狀細胞上清對肝癌細胞MHCC-LM3形態的影響

MHCC-LM3呈卵圓形、長橢圓形的上皮樣細胞形態，其形態規則，相互間排列緊密，經與肝星狀細胞LX-2上清共培養12、24、48 h后，其細胞形態與對照組相比，逐漸由圓形片團狀生長變化為長梭形，細胞的移動不像對照組細胞整片或整塊地移動，能單個活動，離開原來的位置，明顯出現EMT的特征性形態學改變，見圖1。

2. 肝星狀細胞上清對肝癌細胞MHCC-LM3侵襲性的影響

肝星狀細胞上清培養的肝癌細胞株MHCC-LM3在12、24、48 h的侵襲細胞數均多于對照組(12 h：68.67±3.61vs. 38.68±5.56，t=13.008、P<0.001；24 h：125.34±5.23vs. 57.06±5.25，t=9.077、P<0.001；48 h：276.38±5.53vs. 108.69±3.55，t=11.067、P<0.001)。實驗組中，肝星狀細胞上清培養24 h時的侵襲細胞數多于12 h時(t=8.162、P<0.001)，48 h時的侵襲細胞數亦多于24 h時(t=10.187、P<0.001)，見圖2。

圖1 肝星狀細胞上清對肝癌細胞株MHCC-LM3形態的影響(×400)

A：對照組；B：實驗組培養12 h；B：實驗組培養24 h；B：實驗組培養48 h

3. 肝星狀細胞上清對肝癌細胞MHCC-LM3中EMT相關上皮標記物的影響

肝癌細胞株MHCC-LM3經與肝星狀細胞LX-2上清培養24、48 h后其上皮標記基因E-cadherin蛋白表達水平均低于對照組，分別為2.020±0.178vs. 1.652±0.021(t=6.067，P<0.001)、1.478±0.262vs. 1.073±0.062 (t=5.377，P<0.001)，而12 h時2組E-cadherin蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。肝癌細胞株MHCC-LM3經與肝星狀細胞LX-2上清培養12、24、48 h后其上皮標記基因Vimentin蛋白表達均高于對照組，分別為1.172±0.182vs. 1.397±0.152 (t=5.071，P<0.001)、1.302±0.062vs. 1.772±0.092 (t=6.827，P<0.001)、1.688±0.123vs. 2.166±0.072(t=5.067、P<0.001)，見圖 3。

討 論

腫瘤微環境是惡性腫瘤生物學特性的研究熱點，腫瘤細胞能表達多種細胞趨化因子受體，并在微環境中其他的基質細胞合成趨化因子的作用下，促使腫瘤生長并向他處轉移。在肝癌組織中，肝星狀細胞是重要的間質細胞。 近年發現EMT在肝癌侵襲轉移的過程中起著重要作用[3]。EMT參與腫瘤的侵襲及轉移，以上皮表型的缺失和間質表型的獲得為主要特征[4]。

活化的肝星狀細胞發生了形態學和功能學的雙重變化，表現為：①細胞體積變大，增殖活躍；②脂質減少或丟失；③α-平滑肌蛋白表達陽性；④不僅對細胞因子如血小板源生長因子、轉化生長因子-β反應性增加，并自分泌大量細胞因子維持其自身活化狀態；⑤同時分泌大量細胞外基質，尤其是Ⅰ、Ⅲ型膠原[5-7]。肝癌的發展和轉移伴隨著肝星狀細胞的活化，肝星狀細胞的活化能否對肝癌的上皮間質轉化起促進作用，目前相關報道較少。本研究中，將人肝星狀細胞LX-2上清與人肝癌細胞MHCC-LM3共培養后，肝癌細胞由原來的圓形片團狀生長變化為長梭形，并且表現出細胞間連接減弱、分離、組織間極性下降的傾向，表現出間質細胞形態特征。隨后的Transwell侵襲試驗結果顯示，肝星狀細胞的上清能夠使得MHCC-LM3細胞更加具有侵襲性，并隨著共培養時間的延長, MHCC-LM3細胞的侵襲能力也隨之增強，符合MHCC-LM3經誘導EMT后侵襲性增強的特點，提示肝星狀細胞可以促進肝癌細胞株MHCC-LM3的EMT，這可能與活化后的肝星狀細胞能夠分泌多種細胞因子影響肝癌細胞微環境有關。

圖2 肝星狀細胞上清對肝癌細胞株MHCC-LM3侵襲性的影響(×200)

A：對照組12 h；B：對照組24 h；C：對照組48 h；D：實驗組12 h；E：實驗組24 h；F：實驗組48 h；G：定量分析結果；與對照組比較，*P<0.01；與實驗組前一時間點比較，#P<0.01

判斷EMT的發生，除細胞形態學發生變化之外，更為重要的指標是其相關標記蛋白表達的變化。上皮標記物E-cadherin是一種跨膜蛋白，在維持上皮結構整體性方面起重要作用，其丟失會使相鄰細胞分離，并導致上皮細胞極性消失，使得相鄰細胞之間連接變得疏松，E-cadherin表達降低或缺失是EMT重要的變化[8]。Vimentin是間質細胞來源的骨架蛋白，在上皮細胞不表達或表達非常低下。這類蛋白增多會導致骨架蛋白構成變化，使上皮源性細胞具有成纖維細胞特征，易于遷移及黏附[9]。因此E-cadherin表達降低，Vimentin間質蛋白表達增高被認為是EMT發生的標志。本研究采用蛋白免疫印跡法檢測EMT相關標記物的表達變化。結果顯示，肝星狀細胞上清與肝癌細胞株MHCC-LM3共培養后，其E-cadherin蛋白表達水平下降、Vimentin蛋白表達水平升高，進一步證實肝星狀細胞對肝癌細胞株MHCC-LM3的EMT起促進作用。

圖3 肝星狀細胞上清對肝癌細胞株MHCC-LM3 EMT相關上皮標記物的影響

A：蛋白免疫印跡結果；B、C：定量分析結果；與對照組比較，*P<0.01；與實驗組前一時間點比較，#P<0.01

綜上所述，肝星狀細胞促進肝癌細胞的EMT，增強肝癌細胞的侵襲能力，而其作用機制將是我們下一步研究的重點方向。

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(本文編輯：林燕薇)

Effect of hepatic stellate cell on epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma MHCC-LM3 cell line

LiBo,MaJun,HeHuan,WangLiping,XuMing.

DepartmentofGastroenterology,GuangdongNO.2ProvincialPeopleHospital,Guangzhou510317,China

,XuMing,E-mail: 177xm@163.com

Objective To investigate the effect of hepatic stellate cells on the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of hepatocellular carcinoma MHCC-LM3 cell line. Methods MHCC-LM3 cells were co-incubated with the culture supernatant of LX-2 in the study group, and the untreated MHCC-LM3 cells were as the control. The morphological changes, invasion ability, and the changes in the expression of E-cadherin and Vimentin proteins were statistically compared between two groups. Results Compared with the control group, the MHCC-LM3 cells co-incubated with the supernatant of LX-2 were elongated and the cell-cell junction became looser. Transwell assay revealed that the quantity of invasive MHCC-LM3 cells co-incubated for 12-, 24- and 48-h in the study group was significantly higher compared with that in the control group (allP<0.01). Meantime, the quantity of invasive MHCC-LM3 cells in the study group was significantly enhanced over the time of incubation (allP<0.01). In the study group, the expression levels of E-cadherin protein after 24- and 48-h incubation were considerably lower than those in the control group (bothP<0.01). The expression levels of Vimentin protein after 12-, 24- and 48- incubation in the study group were significantly up-regulated compared with those in the control group (allP<0.01). Conclusion Hepatic stellate cells can promote the EMT and enhance the invasion of hepatocellular carcinoma MHCC-LM3 cell line.

Hepatocellular carcinoma; Hepatic stellate cell; Epithelial-mesenchymal transition

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.12.004

510317 廣州，廣東省第二人民醫院消化科(李博，許鳴)；528031 佛山，佛山市第二人民醫院消化科(馬俊，王麗萍)；510030 廣州，廣東省婦幼保健院(賀歡)

，許鳴，E-mail：177xm@163.com

2016-07-13)