基于質譜技術應用CLINPROT系統建立乳腺癌診斷模型*

楊 帆，陳英劍，胡成進△

(1.錦州醫科大學研究生院，遼寧錦州 121001；2.濟南軍區總醫院實驗診斷科，濟南 250031)

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·論 著·

基于質譜技術應用CLINPROT系統建立乳腺癌診斷模型*

楊 帆1，陳英劍2，胡成進2△

(1.錦州醫科大學研究生院，遼寧錦州 121001；2.濟南軍區總醫院實驗診斷科，濟南 250031)

目的 應用液體蛋白芯片-飛行時間質譜技術(CLINPROT)系統篩選乳腺腫瘤患者血清中潛在的腫瘤標志物，并基于差異蛋白建立乳腺癌診斷預測模型。方法 收集病理確診的乳腺癌患者血清標本43例及健康女性血清標本24例，并隨機分為建模組和驗證組。應用ClinProt Tools系統對建模組中的乳腺癌患者和健康女性血清進行差異蛋白的篩選，建立差異蛋白質圖譜，應用ClinProTools v3.0 軟件建立乳腺癌診斷預測模型，而后利用該診斷模型對驗證組血清標本進行分組驗證，初步評估該模型的診斷效能。結果 通過分析病例組和對照組質譜峰信息，得到24個具有明顯差異的蛋白峰(P<0.05)。根據遺傳算法選取表達差異最顯著的3個蛋白質建立乳腺癌診斷預測模型，該模型對建模組乳腺癌的識別能力為91.67%。后利用驗證組標本對該模型的診斷效能進行評估，結果顯示其對驗證組乳腺癌識別準確率為85.7%。 結論 利用ClinProt Tools v3.0軟件成功建立并評估了乳腺癌診斷預測模型，為乳腺癌診斷提供了新的途徑。

液體蛋白芯片-飛行時間質譜技術； 乳腺癌； 診斷模型

液體蛋白芯片-飛行時間質譜技術(CLINPROT)系統是由德國布魯克道爾頓公司基于質譜開發的蛋白質組學分析和鑒定系統。該系統主要由4個子系統組成：磁珠富集低豐度蛋白質/多肽、質譜采集、CLINPROT軟件和體液樣品自動處理系統。基本過程：將患者或健康對照的臨床樣品通過磁珠進行分離，去除樣品中的高豐度蛋白和雜質，將分離后的蛋白質/多肽樣本與基質混合后，直接點在拋光靶上，通過MALDI TOF/TOF MS進行分析，得到兩組蛋白的總質譜圖，通過CLINPROT系統比較病例組與對照組表達差異的蛋白，生成平均質譜圖、膠狀圖等，用于臨床未知樣品的預測[1]。目前，多項研究均利用了CLINPROT系統對腫瘤標志物進行了前瞻性研究，包括宮頸鱗狀細胞癌、食管鱗狀細胞癌、胃癌、口腔鱗狀細胞癌等[2-5]。CLINPROT系統作為蛋白質組學研究的新技術，為發現新型腫瘤標志物提供了新的途徑。本研究應用該技術對乳腺癌患者血清蛋白進行了初步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集濟南軍區總醫院甲狀腺乳腺外科2015 年 1 月至2016 年 1 月收治的乳腺癌女性患者血清標本43例作為病例組，平均年齡(45.0±3.4) 歲。所有標本均經術后病理學確診，術前均未進行臨床治療。另選濟南軍區總醫院同期健康體檢的女性血清24例作為對照組，納入對照女性既往無乳腺癌及相關疾病，體檢未見其他惡性疾病，平均年齡(43.0±5.2)歲。病例組與對照組年齡等一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 試劑與儀器 弱陽離子交換磁珠分析試劑盒(MB-WCX)、疏水磁珠分析試劑盒(MB-HIC C8)、金屬螯合磁珠分析試劑盒(MB-IMAC-Cu)和標準蛋白/多肽購自德國 Bruker公司。三氟乙酸(TFA)、乙腈、丙酮購自Sigma-Aldrich公司。血清蛋白質譜圖的采集采用德國Bruker公司基質輔助激光解析串聯飛行時間/飛行時間質譜儀，并使用儀器原裝進口配套的試劑和定標品。

1.3 方法

1.3.1 標本采集和預處理 受檢對象均進行清晨空腹采血，采集靜脈血5 mL，3 000 r/min離心5 min分離血清，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 3種磁珠分析試劑盒富集血清低豐度蛋白 分別采用不同分離原理的磁珠試劑盒MB-WCX、MB-HIC C8、MB-IMAC-Cu提純4例乳腺癌患者和4例健康對照女性血清中的低豐度蛋白，根據平均出峰量、信噪比、峰強度等系數比較3種分離試劑盒的提純效果。

1.3.3 CLINPROT系統重復性檢測 將已富集的4例乳腺癌患者和4例健康對照女性血清中的低豐度蛋白經MALDI-TOF/TOF MS連續檢測5次，分別獲得不同批間質譜圖。再應用ClinProt Tools v3.0軟件分析采集質譜圖，計算每批質譜圖的變異系數(CV)，通過比較批間變異系數變化評價本方法的重復性。

1.3.4 MB-WCX富集血清低豐度蛋白 根據磁珠分選結果，采用弱陽離子交換磁珠分析試劑盒處理43例乳腺癌和24例健康女性血清標本。(1) 磁珠吸附標本。將10 μL MB-WCX磁珠、10 μL結合緩沖液(BB)和5 μL 待測血清加入樣品管，顛倒混勻；室溫靜置 5 min；利用磁性分離器分離磁珠1 min，使磁珠與上清液徹底分離；用加樣槍吸出上清液，應避免槍頭接觸和吸走磁珠；(2)洗滌磁珠。加入100 μL 洗滌緩沖液(WB)；在磁性分離器相鄰位置反復移動，徹底分離上清液；(3)洗脫磁珠。將分離后的上清液中加入5 μL洗脫緩沖液(EB)混勻，將樣品管置于磁珠分離器中靜置2 min，分離上清液，最后加入5 μL穩定緩沖液(SB)，充分混勻后，24 h內利用MALDI TOF/TOF MS進行分析。

1.3.5 樣品上樣分析 稀釋1 μL多肽樣品溶液于10 μL混合基質溶液中，充分混勻；加1 μL混合液于MTP 384 target plate polished steel BC靶板的相應位置上，室溫風干后進行質譜分析,采集每例血清標本低豐度蛋白表達質譜圖。

1.3.6 生物信息學及數據統計學分析 (1)FlexAnalysis軟件數據分析。在FlexAnalysis軟件中打開待分析數據，編輯找峰參數，通過平滑、基線處理、校正等方法對數據進行處理后，進行標峰，并檢查已采集圖譜質量。(2)ClinProt Tools v3.0軟件建立乳腺癌診斷模型。打開ClinProt Tools v3.0軟件，設置一般參數并對數據進行平滑、對齊、歸一化處理，然后將模型組(36例乳腺癌患者和17例健康女性標本)質譜圖調入軟件，對所有峰進行統計分析，同時生成峰統計列表和準膠圖，在對每張譜圖中的峰高和峰面積進行標注。最后利用對峰參數的統計結果，根據遺傳算法建立乳腺癌診斷預測模型。(3)乳腺癌診斷模型的驗證。利用ClinProt v3.0軟件用建立的乳腺癌診斷模型對驗證組標本(7例乳腺癌和7例健康對照)進行雙盲驗證，檢測診斷模型的診斷價值。

2 結 果

2.1 磁珠分選結果 本研究首先對3種磁珠分離蛋白質/多肽方法MB-WCX、MB-HIC C8、MB-IMAC-Cu進行了比較，以選擇最佳的富集方法進行后續的大樣本試驗。利用3種磁珠富集4例乳腺癌患者和4例健康對照女性血清中的低豐度蛋白，然后通過MALDI TOF/TOF MS的FlexControl軟件進行質譜圖的采集，分別生成3種方法的峰統計列表，經比較后發現 MB-WCX在平均出峰量、平均峰面積、平均峰強度等方面均優于MB-HIC C8和MB-IMAC-Cu。因此選擇MB-WCX作為后續大樣本血清富集方法。

2.2 CLINPROT系統重復性檢測 反復測定8例標本(4例乳腺癌血清、4例健康女性血清)富集的低豐度蛋白，經MALDI-TOF/TOF MS和ClinProt Tools v3.0軟件分析，得到5次測定質譜圖信息和平均CV，結果顯示5次測定質譜圖基本一致，病例組平均CV為24.5%，對照組平均CV為19.7%，當CV<30%，即表明該方法重復性良好。

2.3 血清差異蛋白的定量分析 將乳腺癌患者和健康對照血清經MB-WCX分析試劑盒富集得到的蛋白質/多肽通過MALDI TOF/TOF MS分別采集兩組質譜圖，應用FlexAnalysis軟件將質譜圖進行均一化處理后，導入ClinProt Tools v3.0軟件進行統計學分析，生成平均質譜圖、峰統計列表、膠狀圖等，發現了24個具有明顯差異的蛋白峰(P<0.05)，其中差異最明顯的分別是Mass 3 348.9、Mass 4 787.5、Mass 5 750.1和Mass 8 141.6(表1)。

表1 乳腺癌和健康對照相比具有明顯差異的蛋白質

2.4 乳腺癌診斷預測模型的建立 將模型組質譜圖導入ClinProt Tools v3.0軟件，根據遺傳算法選取表達差異最顯著的3個蛋白質建立乳腺癌診斷預測模型，對乳腺癌和健康對照的識別能力分別為91.6%和100.0%，建立模型的3個蛋白質曲線下面積分別為0.84、0.86和0.85。后為了驗證該模型的診斷效能，利用驗證組標本對該診斷模型進行驗證，結果顯示其對乳腺癌和健康對照的識別準確率均為85.7%(6/7)。診斷乳腺癌的靈敏度為85.7%，特異度為85.7%，Youden指數為0.714。根據ClinProt Tools選取的兩個差異較為明顯的蛋白質Mass 3 348.9和Mass 5 750.1進行聚類分析，可見兩組交叉面積較小，且趨勢明顯，說明該模型鑒別能力較好。

3 討 論

腫瘤性疾病的早期發現、診斷和治療是降低病死率和改善患者生活質量的重要途徑。乳腺癌早期臨床癥狀不明顯，患者一般至預后較差的中后期就診，大大降低了生存率[6-7]。目前乳腺癌診斷還是依靠影像學檢查和病理診斷為依據[8-10]，而有研究表明在腫瘤性疾病發病早期，血液中腫瘤標志物的升高要先于影像學檢查[11]。在腫瘤發生、發展的過程中，會同時伴隨著多種生物標志物不同程度的升高或降低。目前，癌胚抗原(CEA)和癌抗原CA15-3等已作為乳腺癌血清標志物開始應用于臨床乳腺癌患者的輔助診斷和預后判斷，但多項研究表明兩者靈敏度以及對乳腺癌的早篩準確率都不夠理想[12-13]。因此，需要更多有關于乳腺血清腫瘤標志物的研究來滿足臨床乳腺癌診斷的需求。

液體芯片-MALDI TOF/TOF MS-CLINPROT系統是近年來蛋白質組學進行高通量分析的一種新技術，其主要優點是操作簡單，節省標本，且能夠直接對臨床標本進行檢測。該技術已經在前列腺癌、卵巢癌和膀胱癌等早期診斷方面進行了一系列的前瞻性研究[14-16]，建立了多種預測診斷模型，同時發現數個有潛力的腫瘤標志物，并通過Mascot搜庫成功鑒定，為腫瘤性疾病致病機制的進一步探索奠定了基礎。

本研究應用液體芯片-MALDI-TOF/TOF MS-CLINPROT系統分析了36例乳腺癌患者和17例健康體檢女性血清蛋白質譜，通過比較發現了24個差異具有統計學意義(P<0.05)的蛋白質/多肽。其中Mass 5 750.1和8 141.6在乳腺癌血清中均呈現表達下調，診斷乳腺癌的ROC曲線下面積分別為0.86和0.85，證明兩個差異蛋白有潛力成為有價值的乳腺腫瘤新型標志物。ClinProt Tools v3.0軟件根據遺傳算法選擇3個差異最顯著的蛋白Mass 3 348.9、Mass 5 750.1和Mass 8 141.6建立了乳腺癌預測診斷模型，該模型能有效地區分乳腺癌和健康人。后通過7例乳腺癌患者和7例健康對照血清對該模型進行了驗證，結果顯示其對乳腺癌診斷的準確率達到85.7%，靈敏度為85.7%，特異度為85.7%，Youden 指數為0.714。該模型的診斷效能明顯高于目前臨床血清標志物的聯合診斷，具有重要的臨床應用前景。

本研究建立了診斷效能較高的乳腺癌預測診斷模型，同時發現了兩個有價值的血清腫瘤標志物，為后續的鑒定和體內生物學效應的探究奠定了基礎。由于本研究時間有限，病例數少，建立的診斷模型有其局限性，今后有待于擴大樣本量進行深入研究。

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Establishment of diagnostic model of breast cancer by using CLINPROT system based on MALDI-TOF/TOF MS*

YANGFan1,CHENYingjian2,HUChengjin2△

(1.PostgraduatesSchool,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121001,China;2.DepartmentofLaboratoryDiagnosis,GeneralHospitalofJinanMilitaryRegion,Jinan,Shandong250031,China)

Objective To use the liquid protein chip-MALDI-TOF/TOF MS CLINPROT system for screening the serum potential tumor markers in the patients with breast tumor and to establish the breast cancer diagnostic prediction model basic on differential protein.Methods Forty-three serum samples from the patients with pathologically diagnosed breast cancer and 24 serum samples from healthy female controls were collected and randomly divided into the construction model group and verification group.The differential protein screening in the breast cancer patients of the constructing model group and healthy female serum was performed by using the CLINPROT system.The differential protein atlas was established.The breast cancer diagnotic prediction model was established by using the Clin Prot Tools v3.0 software.Then the diagnostic model was applied to perform the grouping verification in the serum samples of verification group.The diagnostic efficiency of this model was preliminarily evaluated.Results Twenty-four protein peaks with significant difference were obtained by analyzing the mass spectrum peak information of the patients group and control group(P<0.05).Three proteins expressing the difference most significantly were selected to build a breast cancer diagnostic prediction model according to genetic algorithm,and the recognition ability of this model for breast cancer in the construction model group was 91.67%.Then the diagnostic efficiency of this model was evaluated by using the samples of verification group,and the results showed that its recognition accuracy rate to breast cancer in the verification group was 85.7%.Conclusion Using the ClinProt Tools v3.0 software successfully constructs and evaluates the diagnostic prediction model of breast cancer,which provides a new pathway for the diagnosis of breast cancer.

CLINPROT system; breast cancer; diagnostic model

國家自然科學基金資助項目(81472497)。

楊帆，女，技師，主要從事臨床檢驗研究。△

，E-mail:hcj6289@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.002

A

1673-4130(2016)24-3388-03

2016-09-07

2016-10-26)