3個道地產區丹參混合提取物對大鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡的影響※

李紅剛 王紅鴿 聶曉楓 孫 陳衛銀

(陜西省渭南職業技術學院醫學院臨床教研室，陜西 渭南 714000)

實 驗 研 究

3個道地產區丹參混合提取物對大鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡的影響※

(陜西省渭南職業技術學院醫學院臨床教研室，陜西 渭南 714000)

目的 通過觀察山東、河南、四川3個道地產區丹參混合提取物對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織B細胞淋巴瘤-2基因(Bc1-2)、腫瘤抑制基因p53的影響，探討3個道地產區丹參對神經細胞凋亡的影響。方法 將60只SD大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、山東丹參組、河南丹參組、四川丹參組，每組10只。用線栓法阻斷大腦中動脈，建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，用蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察缺血腦組織的病理學變化，采用免疫組化法檢測再灌注24 h后各組Bc1-2和p53蛋白的表達。結果 正常組和假手術組細胞與間質之間界限清楚，細胞核完整，核仁清晰；模型組細胞與間質之間界限不清楚，大部分組織細胞壞死，多數細胞溶解呈空泡狀，可見核固縮和核碎裂；3個道地產區丹參組腦組織細胞壞死程度均較模型組輕，可見少量細胞核固縮及溶解，部分胞質液化。正常組、假手術組Bcl-2的積分光密度值(IOD)較少，二者比較差異無統計學意義(P>0.05)；模型組Bcl-2的IOD值較正常組、假手術組增加(P<0.05)；與模型組比較，3個道地產區丹參組均能上調Bcl-2的IOD值(P<0.05)；與河南、四川丹參組比較，山東丹參組上調Bcl-2的IOD值的幅度最大(P<0.05)。正常組、假手術組p53的IOD值較少，二者比較差異無統計學意義(P>0.05)；模型組p53的IOD值較正常組、假手術組增加(P<0.05)；與模型組比較，3個道地產區丹參組均能降低p53的IOD值(P<0.01)；與河南丹參組比較，山東、四川丹參組降低p53的IOD值的幅度最大(P<0.05)。結論 3個道地產區丹參混合提取物均能通過上調Bcl-2表達、降低p53表達，從而抑制神經細胞凋亡，發揮腦保護作用。不同產區丹參混合提取物對各指標表達影響不同，其原因可能與不同產區丹參混合提取物所含活性成分的含量不同，作用靶點不一致有關。

疾病模型，動物；腦缺血；神經元，細胞學；細胞凋亡；再灌注損傷；丹參

丹參是常用活血化瘀藥之一，其對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的影響報道較多，其單體成分通過不同途徑對腦缺血再灌注損傷起到保護作用，但未見不同產地丹參對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型影響的報道。本實驗研究選取山東、河南、四川3個道地產區丹參混合提取物，旨在觀察不同產區丹參對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織B細胞淋巴瘤-2基因(Bc1-2)、腫瘤抑制基因p53的影響，從而探討其對神經細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，購于四川大學實驗動物中心，合格證號：scxk(川)-10-2006，雌雄各半，鼠齡7～8周，清潔級，體質量平均(275.35±24.28) g。在成都中醫藥大學時間生物學實驗室(TCM-03-150)喂養。手術前后常規飼養，室溫保持23～25 ℃，自由進水、進食。

1.1.2 藥品與試劑 采取四川省德陽市中江縣古店鄉、山東省臨沂市沂南縣、河南省南陽市方城縣栽培丹參根10 kg，樣品采集后快速運回實驗室，經常規加工處理后，干燥成藥材，由成都中醫藥大學藥學院提取制成0.4 g/mL生藥的供試品溶液。兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體、兔抗大鼠p53單克隆抗體 (均購自北京博奧森生物技術有限公司)；生物素化羊抗兔IgG抗體(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)造模方法采用在 Zea longa[1]基礎上改良的造模方法頸內動脈線栓加環扎法。將60只SD大鼠隨機分為正常組(n=10)、假手術組(n=10)、模型組(n=10)、四川丹參組(n=10)、山東丹參組(n=10)及河南丹參組(n=10)。

1.2.2 治療方法 正常組：不予任何干預手段；假手術組：暴露右側頸總動脈分叉，然后縫合皮膚，術前5 d予0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次，術后2 h予0.9%氯化鈉注射液再灌胃1次；模型組：MCAO造模90 min后再灌注，造模前5 d予0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次，再灌注后2 h予0.9%氯化鈉注射液再灌胃1次；四川丹參組、山東丹參組、河南丹參組：MCAO造模90 min后再灌注，造模前5 d分別予四川、山東、河南丹參混合提取物灌胃，每日1次，再灌注后2 h再灌胃1次。再灌注24 h后處死大鼠。根據人和動物用量體表面積換算法[2]計算，實驗中丹參混合提取物的灌胃劑量為6.75 mL/kg。

1.2.3 大鼠死亡情況 正常組、假手術組無死亡，模型組死亡2只，四川丹參組死亡3只，山東丹參組和河南丹參組各死亡4只，故按照山東丹參組和河南丹參組大鼠存活數，在其他各組存活大鼠中每組隨機選取6只進行統計分析。

1.2.4 蘇木精-伊紅(HE)染色法及免疫組化檢測方法 病理組織切片標本收集及處理：①各組大鼠再灌注后24 h灌注取腦并固定，固定72 h后做成石蠟切片，每個標本各取1張用于HE染色。②應用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP)進行，一抗為兔抗大鼠Bcl-2、p53單克隆抗體，二抗為生物素化羊抗兔IgG抗體,封片后再采用光鏡觀察。③免疫組化染色結果拍照后進行半定量分析，并計算陽性細胞的積分光密度值(IOD)。

2 結 果

2.1 各組大鼠光鏡下組織病理學改變 見圖1。

圖1 各組大鼠光鏡下組織病理學改變(HE，×100)

由圖1可見，正常組和假手術組細胞與間質之間界限清楚，細胞核完整，核仁清晰；模型組細胞與間質之間界限不清楚，大部分組織細胞壞死，多數細胞溶解呈空泡狀，可見核固縮和核碎裂；3個道地產區丹參組腦組織細胞壞死程度均較模型組輕，可見少量細胞核固縮及溶解，部分胞質液化。

2.2 各組大鼠Bcl-2的IOD值比較 見表1。

表1 各組大鼠Bcl-2的IOD值比較

組 別nBcl-2(×106)正常組60.49±0.11假手術組60.50±0.06模型組61.43±0.33*山東丹參組63.44±1.39△河南丹參組62.42±0.88△#四川丹參組62.36±0.90△#

與正常組、假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與山東丹參組比較，#P<0.05

由表1可見，正常組、假手術組Bcl-2 IOD值較少，二者比較差異無統計學意義(P>0.05)；模型組Bcl-2的IOD值較正常組、假手術組增加(P<0.05)；與模型組比較，3個道地產區丹參組均能上調Bcl-2的IOD值(P<0.05)；與河南、四川丹參組比較，山東丹參組上調Bcl-2的IOD值的幅度最大(P<0.05)；河南丹參組與四川丹參組比較差異無統計學意義(P>0.05)。各組對Bcl-2表達的影響見圖2。

圖2 各組對Bcl-2表達的影響(免疫組化染色，×400)

2.3 各組大鼠p53的IOD值比較 見表2。

由表2可見，正常組、假手術組p53的IOD值較少，二者比較差異無統計學意義(P>0.05)；模型組p53的IOD值較正常組、假手術組增加(P<0.05)；與模型組比較，3個道地產區丹參組均能降低p53的IOD值(P<0.01)；與河南丹參組比較，山東、四川丹參組降低p53的IOD值的幅度最大(P<0.05)；山東丹參組與四川丹參組比較差異無統計學意義(P>0.05)。各組對p53表達的影響見圖3。

表2 各組大鼠p53的IOD值比較

組 別np53(×105)正常組60.81±0.25假手術組60.79±0.23模型組618.46±1.86*河南丹參組69.00±2.19△山東丹參組64.41±1.32△#四川丹參組64.21±1.52△#

與正常組、假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.01；與河南丹參組比較，#P<0.05

圖3 各組對p53表達的影響(免疫組化染色，×400)

3 討 論

腦缺血再灌注是指腦缺血一段時間后，再恢復其血液供應的過程。多數研究表明，腦缺血再灌注后腦缺血性的損傷反而會加重，其機制非常復雜，包括興奮性氨基酸的神經毒性作用、白細胞滲透、血小板和補體激活、細胞內鈣離子超載、炎性細胞因子損傷、過度灌注、凋亡調控基因的激活等因素[3]。腦缺血再灌注后細胞壞死和細胞凋亡并存，細胞壞死主要位于缺血中心區，是不可逆的；而細胞凋亡主要出現在缺血灶周圍區即缺血半暗帶，是可逆的。因此，腦缺血再灌注后神經細胞凋亡已成為研究熱點。

現已知與神經細胞凋亡相關的基因可分為兩大類[4]：一類是抑制凋亡的基因，如Bc1-2等；另一類是促進細胞凋亡的基因，如p53、bax等。本實驗研究選取Bc1-2和p53作為觀察指標，探討3個道地產區丹參混合提取物對大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經細胞凋亡的影響。

關于丹參藥材的道地產區，郭寶林等[5]考證，《名醫別錄》述“生桐柏山谷及太山”(今河南和湖北交界及山東泰山一帶)，《圖經本草》述“今陜西河東州郡及隨州皆有之”(今山西、湖北，河東州郡應歸為山西而非陜西)，《本草品匯精要》述“道地隨州”(今湖北隨州)，《藥物出產辨》述“產四川龍安府為佳”(今四川平武)，可見在歷史上湖北、河南、山東、山西、四川等幾個省都曾被視為丹參的道地產區。近代以來, 四川產丹參被視為佳品，《中國道地藥材》[6]將丹參列為四川產道地藥材。總結起來，文獻記載的丹參道地產區主要有四川、河南、山東、山西及湖北5個產地。多數研究表明，不同產地丹參中丹參酮ⅡA、丹酚酸和丹參素等活性成分的含量差別較大。本實驗研究所選用四川省德陽市中江縣古店鄉、山東省臨沂市沂南縣、河南省南陽市方城縣3個道地產區丹參，經測定丹參酮ⅡA、丹酚酸和丹參素等活性成分的含量差別較大，與多數文獻報道結果相似[7-8]。

Bcl-2、p53是目前研究較多的一對凋亡調控基因。Bcl-2基因首先在血液淋巴細胞中發現，近年來研究發現Bcl-2是細胞凋亡的重要抑制基因，它在腦缺血中表達并起重要作用[9]。p53是1979年Lane DP等[10]在DNA病毒SV40感染的哺乳動物細胞中發現的，因其相對分子質約53×103(53KD)，故簡稱p53。Villunger A等[11]認為，p53是引起缺血再灌注后神經元凋亡的關鍵因素?？傊?，腦缺血再灌注后腦內p53表達明顯增加，活性提高?？梢姡珺cl-2和p53基因對腦細胞凋亡起重要作用，二者表達水平的高低與凋亡的嚴重性直接相關，Bcl-2升高，抑制細胞凋亡；p53升高，促進細胞凋亡[12-13]。

觀察結果表明，山東、河南、四川3個道地產區丹參混合提取物均能明顯提高Bcl-2表達，降低p53表達，表明3個產區丹參混合提取物通過上調Bcl-2、下調p53表達而抑制神經細胞凋亡，從而改善缺血再灌注損傷而發揮腦保護作用。同時發現，3個道地產區丹參混合提取物對Bcl-2和p53表達的影響不同，對Bcl-2的表達，山東丹參組上調的幅度大于河南丹參組、四川丹參組(P<0.05)；河南丹參組與四川丹參組比較差異無統計學意義(P>0.05)。對p53的表達，山東丹參組、四川丹參組降低p53的幅度大于河南丹參組(P<0.05)；山東丹參組與四川丹參組比較差異無統計學意義(P>0.05)。綜上，3個道地產區丹參混合提取物均能影響Bcl-2、p53表達，抑制神經細胞凋亡，從而發揮腦保護作用。不同產區丹參混合提取物對各指標表達影響不同，其原因可能與不同產區丹參混合提取物所含活性成分的含量不同，作用靶點不一致有關。

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(本文編輯：習 沙)

Effecs of Danshen mixed extract from 3 genuine producing areas on nerve cells apoptosis in cerebral ischemia and reperfusion rats

LIHonggang,WANGHongge,NIEXiaofeng,etal.

ClinicalTeachingandResearchSection,MedicalSchoolofWeinanVocationalTechnicalInstituteinShanxiProvince,Shanxi,Weinan714000

Objective To observe the effecs of Danshen mixed extract from 3 genuine producing areas (Shandong, Henan, Sichuan) on B-cell lymphoma-2 gene (Bcl-2) and tumor suppressor gene p53 in cerebral ischemia and reperfusion rats, to investigate the effects Danshen of three difference area on nerve cells apoptosis. Methods 60 SD rats were randomly divided into normal group, shame operation group, model group，Shandong Danshen group, Henan Danshen group and Sichuan danshen group, 10 rats in each group. The rats model of focal cerebral ischemia-reperfusion were established with the middle cerebral artery occlusion .The pathologic change of cerebral ischemia tissue was observed by HE staining. The expressions of Bc1-2 and p53 after 24 reperfusion were observed by mean of immunohistochemistry. Results Cells in normal and shame operation group had clear margin with mesenchyme, integral nucleus and clear nucleolus. Cells in model group had unclear margin with mesenchyme, many cytolysis showed vacuole-shape, and the karyopyknosis and nuclear fragmentation were observed. The necrotic degree of brain tissue cells in three genuine producing areas were lighter than model group, there were few karyopyknosis and karyolysis, partial plasmatosis. The integrated optical density (IOD) of Bcl-2 in normal and shame operation group was fewer, with no statistical difference between two groups (P>0.05). The IOD of Bcl-2 in model group was increased as compared with the normal and shame operation group (P<0.05). As compared with model group, the IOD of Bcl-2 in three genuine producing areas were up-regulation (P<0.05). As compared with Henan and Sichuan danshen group, the IOD of Bcl-2 in Shandong Danshen group had maximum enhanced amplitude (P<0.05). The IOD of p53 in normal and shame operation group was fewer, with no statistical difference between two groups (P>0.05). The IOD of p53 in model group was increased as compared with the normal and shame operation group (P<0.05). As compared with model group, the IOD of p53 in three genuine producing areas were down-regulation (P<0.01). As compared with Henan danshen group,the IOD of p53 in Shandong and Sichuan Danshen group had maximum reduction amplitude (P<0.05). Conclusion Danshen mixed extract from 3 genuine producing areas can up-regulate Bcl-2 and down-regulate the p53, thus inhibit the neuronal apoptosis, play a role in cerebral protection. Danshen from difference ares with difference effects on various indexes, which may be related with difference content of active ingredients and action targets inconformity.

Disease model; Animals; Cerebral ischemia; Nerve cell; Cytology; Apoptosis; Reperfusion injury; Danshen

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.10.018

※ 項目來源：渭南職業技術學院院級科研項目(編號：WZYY201322)

李紅剛(1979—)，男，主治醫師，講師，碩士。從事內科學臨床、教學及科研工作。

R-332；R322.8；R329.25；R341；R743.31

A

1002-2619(2016)10-1515-05

2016-07-28)

△ 通訊作者：成都中醫藥大學附屬醫院神經內科，四川 成都 610072