甘肅地區孕婦孕中期干血斑產前篩查結果分析

劉芙蓉，郝勝菊，王 興，鄭 雷，閆有圣

(甘肅省婦幼保健院醫學遺傳學中心，蘭州 730050)

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·論 著·

甘肅地區孕婦孕中期干血斑產前篩查結果分析

劉芙蓉，郝勝菊△，王 興，鄭 雷，閆有圣

(甘肅省婦幼保健院醫學遺傳學中心，蘭州 730050)

目的 通過檢測孕婦的干血斑甲胎蛋白(AFP DBS)、干血斑游離絨毛膜促性腺激素-β亞基(free-βhCG DBS)濃度，對孕中期胎兒患唐氏綜合征(DS)、18-三體綜合征(ES)和神經管畸形(ODNT)的風險進行評估。方法 運用時間分辨熒光法定量測定孕婦干血斑中AFP DBS、Free-βhCG DBS濃度，采用Life cycle 3.2軟件計算風險。結果 5 001例孕婦中高齡65例，占總篩查人數的1.3%，其中DS、ES和ONTD的陽性篩查率分別為3.7%(185/5 001)、0.4%(20/5 001)和4.3%(215/5 001)。確診陽性病例8例，其中高齡5例。結論 孕婦孕中期干血斑DS產前篩查對實現質控統一管理，提高篩查覆蓋度，降低出生缺陷有重要意義。

孕中期； 唐氏綜合征； 干血斑產前篩查

唐氏綜合征(DS)產前篩查是采用簡單、方便、易行、無創的檢測方法，在廣大孕婦人群中篩查出懷有某些先天缺陷的高危胎兒的高危個體。DS是先天缺陷的主要疾病之一，目前尚無有效治療手段，唯一可行的干預措施是通過產前篩查和產前診斷盡早發現，及時終止妊娠，有效預防和減少DS患兒出生，降低出生缺陷，提高人口素質。目前，我國DS產前篩查的主要模式為孕中期孕婦血清二聯或三聯篩查，但覆蓋率不高，偏遠貧困地區仍無法開展DS篩查。據統計，我國發達地區篩查率可達50%，篩查覆蓋率全國平均僅為13%，明顯落后發達國家[1-2]。同時，血樣轉運困難，篩查中心分散，質控管理難度大、成本高。DS干血斑產前篩查技術由于其具有標本采集簡單、轉運成本低廉、標本穩定性增強、實驗統一性提高、便于質控管理等優勢，適合偏遠不發達地區提高產篩覆蓋率。本研究通過對2015年1～6月甘肅地區孕婦孕中期干血斑產前篩查的結果進行分析，闡明其在產前篩查中的優勢及局限。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1～6月甘肅省婦幼保健院產前診斷中心進行孕中期干血斑產前篩查的孕婦5 001例。孕婦知情同意并填寫產前篩查申請單，孕周15～20周+6，其中65例年齡大于35歲，平均年齡28.65歲。月經規律者根據末次月經推算孕周，月經不規律者以B超測得胎兒雙頂徑(BPD)推算孕周。

1.2 標本采集 制作濾紙干血片標本，參照2010年《新生兒篩查技術規范》要求制作保存血膜，濾紙采用貴州里定生物科技有限公司生產的血標本采集卡，血斑制作采用可控式點血器法(DIFF-SAFE)[3]，制備直徑大于10 mm的濾紙血斑3個，于室溫下干燥后，密封于4 ℃冰箱中保存待檢。

1.3 試劑與方法 儀器采用芬蘭Wallac公司生產的DELFLA-1235型全自動時間分辨免疫熒光分析儀進行測定。檢測試劑盒運用蘇州新波生物技術有限公司生產的干血斑甲胎蛋白與游離人絨毛膜促性腺激素-β亞基(AFP/Freeβ-HCG DBS)雙標試劑盒。

1.4 檢測方法 用直徑為3.2 mm的打孔器在血斑半徑1/2 處打下待檢血斑1個于反應微孔中，其中將標準品和質控品各2個(復孔)于相應反應微孔中，上機選擇相應AFP/Free-hCGbβDBS程序進行檢測。

1.5 風險評估 采用PE公司提供的Life cycle3.2軟件結合孕婦年齡、體質量、孕周、是否吸煙及相關病史等因素，將血斑測定值換算成中位數倍數值(MOM值)，計算胎兒患DS、18-三體綜合征(ES)及神經管畸形(ONTD)的風險率。DS風險截斷值為1/270；ES風險截斷值為1/350,ONTD風險截斷值為MOM≥2.5。對篩查出的高危妊娠孕婦，在本人知情同意的情況下，建議接受羊膜腔穿刺，進行羊水細胞培養及染色體核型分析，對篩查對象追蹤隨訪至胎兒出生。

2 結 果

2.1 篩查結果 本中心共接收5 001例進行DS孕中期產前篩查的干血斑，其中篩出DS高風險185例，ES高風險20例,ONTD高風險215例。其中年齡大于35歲的孕婦共65例，占篩查人群的1.3%。DS的初篩陽性率為3.7%(185/5 001)，ES的初篩陽性率為0.4%(20/5 001)，ONTD的初篩陽性率為4.3%(215/5 001)，總陽性篩查率為8.4%(470/5 001)。見表1。

表1 各年齡組DS陽性篩查率

2.2 各孕周不同標記物的中位數濃度及MOM值 本研究中所有待檢孕婦的孕周均介于15～20周+6，干血斑甲胎蛋白(AFP DBS)與干血斑游離絨毛膜促性腺激素-β亞基(free-βhCG DBS)兩種標記物在各孕周均有差異，其中AFP DBS隨孕周的增加而逐漸增高，妊娠15周的中位數濃度為24.16 mU/L，妊娠20周升高至43.25 mU/L；free-βhCG DBS隨孕周的增加中位數濃度逐漸降低，妊娠15周的中位數濃度為36.53 ng/mL，妊娠20周下降至15.75 ng/mL。見表2。

表2 各孕周不同標記物的中位數濃度及MOM值

2.3 陽性確診病例結果分析 初篩陽性患者在本院產前診斷中心接受羊膜腔穿刺，進行羊水細胞培養及染色體核型分析，妊娠結局是確診陽性患者8例，其中高齡5例，確診21-三體胎兒5例，18-三體胎兒1例，超雌胎兒1例，克氏綜合征1例。篩查低風險孕婦中至今無DS、ES及ONTD患兒出生。其染色體核型分析結果見表3。

表3 染色體異常兒的篩查結果

續表3 染色體異常兒的篩查結果

注：-表示無數據。

3 討 論

3.1 實施產前篩查在我國普及難度大,而以濾紙干血斑作為母血載體進行DS產前篩查經濟簡便[4],成為目前的研究熱點之一。干血斑DS產前篩查結果顯示，生育患兒風險隨年齡增長而增長。Wald等[5]報道，僅通過年齡對DS產前篩查檢出率可達30%。據文獻統計，所有出生的DS患兒中35歲以前婦女娩出的占30%,35歲以后的婦女娩出70%[6]。Merkatz等[7]將血清甲胎蛋白(AFP)應用于DS產前篩查,結合年齡因素可將檢出率提高20%。將不同標志物的擬然比相乘，再乘以孕婦年齡特異性風險得到孕婦DS風險值,若評估風險等于或高于截斷值1/270，為篩查高風險，需行羊水穿刺；若風險介于1/270～1/1 000，為臨界風險，需行羊水穿刺或無創產前篩查；若風險低于1/1 000，則為低風險，需后續觀察，做好妊娠隨訪。

AFP主要來源于胎兒肝臟和卵黃囊,由胎肝細胞合成,胎兒血中AFP通過被動傳遞方式進入母血和羊水。母血中AFP在妊娠15周開始上升,孕32～34周達到高峰。若胎兒神經管發育異常,致使更多AFP進入羊水，則AFP異常升高。DS胎兒由于肝臟發育不成熟,AFP合成減少,所以母血中含量相應下降。本研究將AFP DBS作為干血斑產前篩查的指標之一，其原理與血清學相同[8]。

絨毛促性腺激素(hCG)由a和β兩個亞基構成,檢測β亞基可避免交叉反應,能更好地反映胎盤功能及胎兒狀況。大約1%的β亞基以游離形式存在。hCG受精后進入母血并快速增殖至孕8周,隨后濃度逐漸降低至孕18～20周并保持穩定。據報道，總hCG在產前篩查應用中檢出率低于free-βhCG[9]。DS患兒的成熟度較正常胎兒晚,雖然妊娠已進入中期,hCG及free-βhCG β仍處于高濃度水平,同時胎盤滋養葉中的巨噬細胞分泌的水解酶將hCG裂解成a、β亞基,DS患兒或胎盤惡性腫瘤母體的水解酶活性增加,使free-βhCG β濃度更高[10]。本研究將free-βhCG DBS作為干血斑產前篩查的指標之一，其原理與血清學相同。

3.2 1963年有研究者首次將干血斑法應用于新生兒先天性代謝性疾病的篩查,此后干血斑法由于其優勢及可行性廣泛應用于其他領域,如藥物代謝、病毒快速診斷等大規模篩查,是一項應用較為成熟的方法[11-13]。近年來,由于PCR等微量擴增及檢測技術的進步,干血斑的應用更取得了長足進步。

干血斑DS產前篩查的優勢如下：(1)標本采集簡便。血斑法采用DIFF-SAFE將血斑均勻滴注至血片,自然晾干，采血量少，簡化了血清學離心、血清分離等步驟,減少了血清處理過程中病毒感染傳播的風險[14]。據報道，人類免疫缺陷病毒(HIV)-1、HIV-2、丙型肝炎病毒等在血斑自然干燥過程中已喪失傳染性,但某些高滴度病毒(如HBV)即使在干血斑中也能存活7 d[15]；(2)經濟學優勢。干血斑血液采集簡便,轉運僅需密封袋密閉或郵寄,降低了血清學方法冷鏈運輸的費用,適于偏遠地區普及篩查度；(3)干血斑有利于檢測物質保存。如AFP DBS血斑可在37 ℃密封保存1個月，4 ℃保存半年。free-βhCG DBS血斑可在4 ℃保存1 d,-20 ℃保存131年。但高溫過高穩定性下降,據報道若溫度高于30 ℃，則AFP DBS 的保存不超過24 h。free-βhCG DBS于20 ℃可保存87.3 h，30 ℃以上保存不超過6 h[16-20]。

MOM值是該指標實際測定的濃度值與同孕周健康人群中位數之比，體現了測定值偏離正常值的程度和方向。若系統長期保持穩定，中位數設置準確合理，MOM值應趨于1.0左右波動，假陽性率和檢出率波動不大；若系統發生調整，中位數設置不準確，則MOM值將逐漸偏離1.0，降低篩查效率。本研究中，MOM的正常參考范圍分別為AFP DBS介于0.7～2.5 MOM，free-βhCG DBS介于0.25～2.5 MOM。當AFP DBS≥2.5 MOM時，篩查結果為ONTD高風險；當free-βhCG DBS≥2.5 MOM時，篩查結果為DS高風險；當free-βhCG DBS<0.25時，常導致ES高風險。表2中各孕周free-βhCG DBS的MOM值穩定在1.0左右波動，而AFP DBS的MOM值較1.0偏大，檢查篩查過程，徹底清潔打孔鉗，充分晾干后，于血斑中心至邊緣1/2處打孔，消除新生兒AFP暫時性增高，不同打孔部位血斑濃度差異等因素的影響。積累大量數據后，調整各項指標MOM值，建立甘肅地區正常孕婦干血斑中孕期濃度的平均水平，合理修正中位數曲線標準，優化實驗流程，提高檢出率和篩查效率。同時，繪制實驗室室內質控，每批實驗free-βhCG DBS的變異系數(CV)值均低于5%，AFP DBS的CV值均低于10%，符合“新生兒篩查技術規范”中要求的CV值低于10%，證明實驗穩定性強，free-βhCG DBS指標的穩定性優于AFP DBS。

3.3 目前我國城市居民產前篩查的覆蓋率僅為30%,而中小城市及偏遠地區未能實現DS產前篩查的普及。因此,尋找一種方便快捷、切實可行的篩查方法,對降低我國出生缺陷勢在必行。本研究中干血斑DS產前篩查的總陽性篩查率為8.4%，假陽性率較高。經妊娠隨訪后，確診8例陽性，其中5例為年齡高風險，與高齡是DS發病的主要因素相吻合。同時，篩查結果為高風險孕婦中確診21-三體胎兒5例，18-三體胎兒1例，超雌胎兒1例，克氏綜合征1例；篩查低風險孕婦中至今無DS、ES及ONTD患兒出生。由于Life Cycle軟件自帶的中位數值來自于高加索人群干血斑濃度,與本研究人群存在地域及人種等方面的差異,且本研究的樣本量不大，可能產生MOM值偏移。據此，在今后的研究中應擴大樣本量，獲取大樣本的本地中位數值,使MOM值分布為中值和眾數均接近1的單峰分布,從而找出最佳中位數的擬合曲線,建立更適合本地人群的風險截斷值，優化干血斑產前篩查體系,加大產前篩查在我國的普及力度。

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Analysis on results of middle pregnancy dried blood spots prenatal screening among pregnant women in Gansu area

LIUFurong,HAOShengju△,WANGXing,ZHENGLei,YANYousheng

(MedicalGeneticCenter,GansuProvincialMaternityandChildHealthCareHospital,Lanzhou,Gansu730050,China)

Objective To evaluate the risk of Down′s syndrome(DS),Edward′s syndrome(ES) and open neural tube defect (ONTD) at the second-trimester by detecting the concentrations of AFP and free-βhCG in dried blood spots (DBS).Methods The concentrations of AFP and free-βhCG in DBS were quantitatively determined by using time-resolved fluorescence method.The risk was calculated by adopting the Life cycle 3.2 software.Results Among 5 001 screened pregnant women,65 cases were advanced age pregnant women,accounting for 1.3%.The positive screening rates of DS,ES and ONTD were 3.7%(185/5 001),0.4%(20/5 001) and 4.3%(215/5 001) respectively.Eight cases were confirmed positive,in which 5 cases were advanced age pregnancies.Conclusion Second-trimester DBS for screening DS has an important significance in realizing the uniform management of quality control,increasing the screening coverage degree and reducing birth defects.

second-trimester; Down syndrome; dried blood spots prenatal screening

劉芙蓉，女，技師，主要從事醫學分子生物學研究。△

，E-mail:76108060@qq.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.016

A

1673-4130(2016)24-3426-04

2016-09-01

2016-10-20)