肺結核患者外周血中Treg細胞和Th17細胞等4種T細胞亞群與其發病的關系

趙 鈺,余紅嵐，宋靜芳，聶澤燕，陳 俊，馬 莉

(1.貴州醫科大學附屬醫院中心實驗室，貴陽 550002;2.貴州省貴陽市第一人民醫院檢驗科 550004)

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·論 著·

肺結核患者外周血中Treg細胞和Th17細胞等4種T細胞亞群與其發病的關系

趙 鈺1,余紅嵐2，宋靜芳2，聶澤燕2，陳 俊2，馬 莉1

(1.貴州醫科大學附屬醫院中心實驗室，貴陽 550002;2.貴州省貴陽市第一人民醫院檢驗科 550004)

目的 通過檢測肺結核患者和健康人群外周血中Treg細胞、Th17細胞以及CD8+CD28+T細胞和CD8+CD28-T細胞的數量，探討各細胞亞群的數量與肺結核發病的關系，為結核的診斷、治療及預后提供新思路。方法 應用流式細胞技術檢測Treg細胞、Th17細胞以及CD8+CD28+T細胞和CD8+CD28-T細胞，分別比較肺結核組、初治組、復治組與健康對照組之間的上述指標是否存在差異。結果 (1)肺結核組、初治組及復治組外周血中Th17細胞的數量分別為(0.74±0.33)%、(0.76±0.34)%、(0.73±0.32)%，CD8+CD28+T細胞的數量分別為(39.5±11.4)%、(39.5±10.9)%、(38.7±12.2)%，均分別低于健康對照組(1.17±0.38)%、(62.5±12.0)%，差異有統計學意義(P<0.01)；(2)肺結核組、初治組及復治組外周血中Treg細胞的數量分別為(10.1±2.7)%、(11.4±3.8)%、(9.4±2.5)%，CD8+CD28-T的數量分別為(60.5±11.4)%、(60.5±10.9)%、(61.3±12.2)%，均分別高于健康對照組的(7.2±2.2)%、(37.5±12.0)%，差異有統計學意義(P<0.01)；(3)初治組患者與復治組患者外周血中Th17細胞、Treg細胞、CD8+CD28+T細胞、CD8+CD28-T細胞數量之間的差異無統計學意義(P>0.05)。結論 肺結核患者外周血中的效應性T細胞亞群Th17細胞和CD8+CD28+T細胞下降，具有抑制功能的CD4+CD25+CD127low/-Treg細胞和CD8+CD28-T細胞升高，以上4個T細胞亞群可能與肺結核的發病過程相關。

肺結核；Treg細胞；Th17細胞；CD8+CD28+T細胞；CD8+CD28-T細胞

隨著Th17細胞和Treg細胞亞群的發現，兩者均迅速成為目前研究的熱點。Th17細胞是近年來發現的一種不同于Th1和Th2細胞的CD4+效應T細胞新亞群，該細胞是由初始T細胞前體分化而來，具有獨立的分化和發育機制，并且特異性地產生細胞因子白細胞介素(IL)-17，并由此命名。研究顯示，與健康對照組相比較，結核性胸膜炎患者外周血中Th17細胞的數量顯著降低[1]。

調節性T細胞(Treg細胞)是一群具有免疫抑制效應的細胞。Treg細胞在維持機體免疫穩態方面發揮著重要作用，其可通過細胞間的接觸抑制(直接抑制)或者釋放IL-10、轉化生長因子(TGF)-β等抑制性細胞因子抑制效應性T細胞的增殖和免疫活性細胞因子的合成來調節體內免疫平衡。研究顯示，與健康人群相比較，肺結核患者外周血中Treg細胞數量顯著升高，抑制效應性T細胞的免疫功能，參與肺結核的發病[2-4]。CD8+CD28+T淋巴細胞主要執行的是細胞毒性T細胞功能，特異性殺傷靶細胞,發揮細胞免疫功能；而CD8+CD28-T淋巴細胞主要參與免疫調節和反饋抑制功能。因此，本課題旨在通過檢測Th17細胞、Treg細胞以及CD8+CD28+T細胞和CD8+CD28-T細胞在肺結核患者外周血中的數量，以期探討以上各細胞亞群與肺結核發病的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2011年12月至2012年3月貴陽市肺科醫院住院部的肺結核患者40例設為肺結核組，男25例，女15例；年齡15～65歲，平均(37±13)歲。其中初治組(未開始用藥)24例，男15例，女9例，平均年齡(38±12)歲；復治組(不規則化療超過1個月)16 例,男11例，女5例，平均年齡(35±12)歲。具有肺結核的相關癥狀和體征，胸部X線片檢查支持肺結核的臨床診斷，同時通過痰涂片和痰培養結果確診為肺結核患者。具體診斷參照《肺結核診斷標準(WS288-2008)》。無合并自身免疫性疾病、腫瘤、糖尿病及慢性感染性疾病；未使用影響機體免疫功能的藥物。隨機選取貴陽市第一人民醫院體檢的健康志愿者30例設為健康對照組，其中男15例，女14例，年齡15～56歲，平均(33±8)歲。胸片檢查未見異常，否認有結核病史，血壓、肝功能、腎功能正常，無過敏性疾病，并且也未曾服用過任何影響機體免疫功能的藥物。所有受試者均簽寫了知情同意書。

1.2 方法 使用美國BD公司生產的流式細胞儀CantoⅡ檢測T細胞亞群，T細胞亞群檢測盒也購于美國BD公司(除用于體外刺激轉化的佛波酯離子霉素，莫能霉素購于美國Sigma公司)，各項操作均嚴格按照說明書進行。

2 結 果

2.1 兩組研究對象外周血中T細胞亞群的結果比較 肺結核組患者的外周血中T細胞亞群與健康對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。表1 肺結核患者和健康對照者外周血中T細胞

亞群的結果比較

注：與健康對照組比較，*P<0.05。

2.2 初治組、復治組和健康對照組外周血中T細胞亞群的結果比較 初治組、復治組患者的T細胞亞群結果與健康對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 初治/復治患者和健康對照者外周血中T細胞

注：與健康對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

目前，長期化療引發了耐藥及多耐藥結核分枝桿菌的出現和肺結核的復發，單純化療已經不能滿足肺結核臨床治療的需要，因此迫切需要從免疫學角度尋求治療手段以達到免疫治療的目的[5]，即增加免疫對機體的保護作用；降低免疫反應對自身造成的病理損傷。

許多報道顯示，抗結核分枝桿菌感染主要由CD4+Th1細胞發揮細胞免疫作用， 而CD8+T細胞的免疫作用報道甚少。此次研究中，肺結核患者外周血中CD8+CD28+T細胞占CD8+T細胞的比例顯著低于健康對照組。推測可能由于機體缺乏激活T淋巴細胞的第二信號，T細胞無法正常活化，導致機體不能對結核分枝桿菌產生有效的免疫應答。

于韜等[6]研究認為，CD8+CD28-T細胞是一種調節性T細胞，其功能的關鍵在于下調機體的免疫反應，防止組織破壞，然而對免疫應答的過度抑制會導致機體無法有效的對抗結核分枝桿菌的感染。本次研究中，CD8+CD28-T細胞占CD8+T細胞的比例顯著高于健康對照組，增強了對機體免疫功能的抑制作用，機體不能有效地殺滅結核分枝桿菌，使得其在體內不斷增殖，促進肺結核的發展。

本次研究顯示，肺結核患者外周血中的CD4+CD25+CD127low/-Treg細胞的百分率顯著升高，與文獻[7]報道一致。有研究認為，CD4+CD25+CD127low/-Treg細胞的免疫抑制性機制是通過細胞膜表面表達的CTLA-4分子實現的抗原特異性的細胞接觸機制，至于該抑制是通過抗原提呈細胞的介導作用還是直接與靶細胞相接觸發揮作用[8]，存在一定的分歧。有文獻報道，Treg細胞發揮抑制作用的機制與刺激抗原的濃度有關，濃度低時只需接觸抑制；濃度高時則需要分泌抑制性細胞因子輔助[9]。本次研究發現肺結核患者外周血中的CD4+CD25+CD127low/-Treg細胞數量顯著高于健康對照組，而Th17細胞和CD8+CD28+T細胞數量顯著性下降。因為CD4+CD25+CD127low/-Treg細胞本身具有抑制其他CD4+T和CD8+T細胞亞群活化增殖的活性，推測CD4+CD25+CD127low/-Treg細胞可能對效應性T細胞(Th17細胞和CD8+CD28+T細胞)有抑制作用，然而關于其確切的抑制機制，仍需進一步的探索。

有研究顯示，CD4+CD25+CD127low/-Treg細胞與Th17細胞在外周血中的平衡狀況，參與自身免疫性疾病及慢性乙型肝炎的發病過程[8-10]。本研究經線性相關性分析結果顯示：肺結核患者外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg細胞與Th17細胞的表達呈顯著負相關。分析可能在結核分枝桿菌感染機體時，由于體內存在多種細胞因子對二者的分化發育發揮促進或抑制作用，最終導致二者在患者外周血中的數量出現失衡，從而參與肺結核的免疫發病過程。

由于本次研究選取的初治組患者未開始用藥，而復治組是不規則用藥超過1個月的患者，與健康對照組相比較，患者外周血中發揮抑制性作用的CD4+CD25+CD127low/-Treg細胞、CD8+CD28-T細胞數量顯著升高，發揮正向調節作用的Th17細胞、CD8+CD28+T細胞數量顯著降低；但兩組患者之間比較，各個細胞亞群的差異無統計學意義(P>0.05)，提示由于用藥不規則，未能有效調動機體主動抗結核免疫機制，外周血中抑制性T細胞占優勢，這可能是導致疾病遷延不愈的一方面原因。

近年來，結核病卷土重來，發病率和復發率逐漸上升，鑒于化療較長的療程及耐藥性的出現，調節機體免疫力對于結核病的防治工作具有重要意義。單純研究CD8+CD28+T細胞、CD8+CD28-T細胞和CD4+CD25+CD127low/-Treg細胞的文章見諸報道，但本次實驗從肺結核患者與健康人群之間以上4個T細胞亞群相比較的角度，發現原有的Th1/Th2細胞平衡機制或者某個細胞亞群的作用研究已經不足以解釋肺結核的免疫發病機理，結果提示Th17細胞、CD8+CD28+T細胞、CD8+CD28-T細胞和CD4+CD25+CD127low/-Treg細胞共同參與了肺結核的發病過程，由此考慮是否可以將其作為患者免疫功能調節的靶點，與化療藥物相結合，從而縮短化療的療程，使疾病盡快得到治愈。盡管參與免疫反應的細胞及其產生的細胞因子比較復雜，并且其彼此之間具有網絡性的相互作用，但本次實驗研究的4個細胞亞群的狀況至少可以為肺結核的臨床診斷、預后及免疫治療提供一種新的思路。

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Relation between 4 kinds of peripheral blood T cell subsets of Treg cell and Th17 cell in patients with pulmonary tuberculosis and its onset

ZHAOYu1,YUHonglan2,SONGJingfang2,NIEZeyan2,CHENJun2,MALi1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,GuiyangMunicipalFirstPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China;2.CentralLaboratory,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

Objective To investigate the relationship between the number of various cellular subsets and pulmonary tuberculosis(TB) onset by detecting the number of peripheral blood Treg cells,Th 17 cells,CD8+CD28+T cells and CD8+CD28-T cells in the patients with pulmonary TB and healthy population so as to provide a new thinking for the diagnosis,treatment and prognosis of TB.Methods Treg cells,Th 17 cells,CD8+CD28+T cells and CD8+CD28-T cells were detected by using flow cytometry (FCM).The differences of these indexes were compared among the pulmonary TB group,initial treatment group,re-treatment group and healthy control group.Results (1) The percentages of peripheral blood Th17 cells and CD8+CD28+T cells in the TB group,initial treatment group and re-treatment group respectively were(0.74±0.33)%,(0.76±0.34)%,(0.73±0.32)% and (39.5±11.4)%,(39.5±10.9)%,(38.7±12.2)% respectivel;which were lower than(1.17±0.38)% and(62.5±12.0)% in the control group,the difference was statistical significance(P<0.01);(2) the percentages of peripheral blood Treg cells and CD8+CD28-T cells in the TB group,initial treatment group and re-treatment group were (10.1±2.7)%,(11.4±3.8)%,(9.4±2.5)% and (60.5±11.4)%,(60.5±10.9)%,(61.3±12.2)% respectively;which were higher than (7.2±2.2)% and(37.5±12.0)% in the healthy control group,the difference was statistical significance(P<0.01);(3) the percentages of peripheral blood Th17 cells,Treg cells,CD8+CD28+T cells and CD8+CD28-T cells had no statistical difference between the initial treatment group and re-treatment group (P>0.05).Conclusion The percentage of peripheral blood effect T cell subsets Th17 cells and CD8+CD28-T cells in the patients with pulmonary TB is decreased,while the percentage of CD4+CD25+CD127low/-Treg cells and CD8+CD28-T cells with the inhibiting effect is increased,these 4 kinds of T cell subsets may be related to the onset process of pulmonary TB.

pulmonary tuberculosis; Treg cell; Th17 cell; CD8+CD28+T cell; CD8+CD28-T cell

趙鈺，女，主管技師，主要從事臨床檢驗研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.019

A

1673-4130(2016)24-3434-03

2016-09-01

2016-10-20)