大劑量糖皮質(zhì)激素應(yīng)用過(guò)程中早期給予ACTH大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能及病理變化

楊麗瀟，張碧麗，王文紅

(1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2天津市兒童醫(yī)院)

大劑量糖皮質(zhì)激素應(yīng)用過(guò)程中早期給予ACTH大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能及病理變化

楊麗瀟1，張碧麗2，王文紅2

(1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2天津市兒童醫(yī)院)

目的 觀察大劑量糖皮質(zhì)激素(GC)應(yīng)用過(guò)程中早期給予促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)大鼠下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的功能及病理變化。方法 將30只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組和治療組，每組10只。正常組予蒸餾水灌胃2周，對(duì)照組和治療組用大劑量醋酸潑尼松水溶液灌胃2周；之后治療組加用ACTH皮下注射2周，其余兩組灌胃方法不變。分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)、實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)2周時(shí)、實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)4周時(shí)測(cè)定大鼠血清皮質(zhì)醇及ACTH；實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)4周時(shí)處死各組大鼠，測(cè)大鼠垂體、腎上腺質(zhì)量并觀察其病理形態(tài)，計(jì)算大鼠臟器指數(shù)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)各組大鼠血清皮質(zhì)醇及ACTH水平相近(P均>0.05)。實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)2周時(shí)，對(duì)照組和治療組大鼠血清皮質(zhì)醇及ACTH水平相近(P均>0.05)。實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)4周時(shí)，治療組大鼠血清皮質(zhì)醇和ACTH水平較對(duì)照組升高(P均<0.05)，且垂體和腎上腺的質(zhì)量及其臟器指數(shù)也較對(duì)照組升高(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)4周時(shí)，各組大鼠垂體遠(yuǎn)側(cè)部未見(jiàn)明顯改變；正常組大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶結(jié)構(gòu)清晰，對(duì)照組較正常組束狀帶變薄且結(jié)構(gòu)紊亂；治療組與對(duì)照組相比束狀帶增厚、細(xì)胞核增多，但較正常組結(jié)構(gòu)排列紊亂。結(jié)論 大劑量GC應(yīng)用過(guò)程中早期給予ACTH可減輕GC對(duì)大鼠HPA軸的抑制作用，促進(jìn)其皮質(zhì)醇和ACTH的分泌，促進(jìn)其垂體和腎上腺的增生，并能明顯改善其腎上腺皮質(zhì)的萎縮情況。

促腎上腺皮質(zhì)激素；糖皮質(zhì)激素；下丘腦-垂體-腎上腺軸；原發(fā)性腎病綜合征；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

兒童原發(fā)性腎病綜合征(PNS)的主要治療藥物是糖皮質(zhì)激素(GC)，尤其是頻繁復(fù)發(fā)和激素依賴(lài)的PNS需要通過(guò)延長(zhǎng)GC療程或加用細(xì)胞毒藥物、免疫抑制劑治療，導(dǎo)致不良反應(yīng)嚴(yán)重[1，2]。患兒長(zhǎng)期使用大劑量外源性GC，可出現(xiàn)下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸抑制，這是PNS出現(xiàn)頻繁復(fù)發(fā)和激素依賴(lài)的重要機(jī)制之一[3]。新近研究[4]發(fā)現(xiàn)，根據(jù)血清皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)水平可以在一定程度上預(yù)測(cè)激素敏感型PNS的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。ACTH是由腦垂體分泌的一種多肽類(lèi)激素，有類(lèi)糖皮質(zhì)激素樣作用，在皮質(zhì)功能尚存時(shí)可刺激腎上腺皮質(zhì)分泌皮質(zhì)醇，對(duì)HPA軸功能有一定的調(diào)節(jié)作用。我們推測(cè)，早期補(bǔ)充外源性ACTH，有望減輕大劑量GC對(duì)大鼠HPA軸的抑制作用，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。2016年4月1日～6月1日，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察了大劑量GC應(yīng)用過(guò)程中早期給予ACTH大鼠HPA軸的功能及病理變化。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、動(dòng)物及試劑 醋酸潑尼松片(5 mg/片)，ACTH1-39(10 mg/支)。健康雄性Wistar大鼠30只，SPF級(jí)，日齡(40±5)d。皮質(zhì)醇檢測(cè)試劑盒，ACTH檢測(cè)試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組 30只雄性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組和治療組，每組10只。

1.2.2 藥物配制及給藥方法 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，正常組大鼠每日1次予4 mL/kg蒸餾水灌胃2周；對(duì)照組、治療組每日1次予大劑量(12.5 mg/kg，相當(dāng)于兒童2 mg/kg)醋酸潑尼松水溶液灌胃，共2周[5]。實(shí)驗(yàn)第3周起，正常組灌胃方法同前；對(duì)照組繼續(xù)每日1次予大劑量醋酸潑尼松水溶液灌胃2周；治療組在大劑醋酸潑尼松水溶液灌胃后每日1次皮下注射ACTH 200 μg/kg，共2周。本實(shí)驗(yàn)共4周，清晨8時(shí)前灌胃、皮下注射完畢。實(shí)驗(yàn)期間，每3 d稱(chēng)大鼠體質(zhì)量1次，以調(diào)整藥物用量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠自由進(jìn)食及飲水，觀察各組大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、外觀、反應(yīng)性、活動(dòng)性、食欲、攝食量及體質(zhì)量變化。

1.2.3 各組大鼠血清皮質(zhì)醇及ACTH測(cè)定 分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)、實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)2周時(shí)、實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)4周時(shí)，在醋酸潑尼松水溶液灌胃前，于大鼠內(nèi)眥取血約2 mL，高速離心后，測(cè)定血清皮質(zhì)醇及ACTH。

1.2.4 各組大鼠垂體、腎上腺質(zhì)量檢測(cè)及病理形態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)4周時(shí)，將各組大鼠稱(chēng)重后斷頭處死，迅速摘取其垂體和雙側(cè)腎上腺(去除腎上腺被膜周?chē)闹炯敖Y(jié)締組織)，稱(chēng)重后將其固定于10%甲醛溶液中，切片、HE染色后觀察病理形態(tài)。同時(shí)計(jì)算大鼠臟器指數(shù)(臟器質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量)。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，各組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，皮毛光亮，反應(yīng)靈敏，活動(dòng)靈活。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，正常組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育較快，皮毛有光澤，反應(yīng)靈敏，活動(dòng)敏捷，體質(zhì)量增長(zhǎng)穩(wěn)定；對(duì)照組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育較差，毛發(fā)無(wú)光澤、蓬亂、容易脫落，反應(yīng)遲鈍，腰腹部肥胖，四肢消瘦明顯；治療組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育尚可，毛發(fā)稍有光澤，反應(yīng)稍遲鈍，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢。各組大鼠均無(wú)感染、死亡。

2.1 各組大鼠血清皮質(zhì)醇及ACTH水平比較 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠血清皮質(zhì)醇及ACTH水平比較見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、垂體和腎上腺質(zhì)量、臟器指數(shù)比較 實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)4周時(shí)各組大鼠體質(zhì)量、垂體和腎上腺質(zhì)量、臟器指數(shù)比較見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠腎上腺和垂體的病理變化 實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)4周時(shí)，各組大鼠垂體遠(yuǎn)側(cè)部未見(jiàn)明顯改變。實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)4周時(shí)，正常組大鼠腎上腺皮質(zhì)球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶及髓質(zhì)結(jié)構(gòu)顯示清楚，排列整齊(圖1A)；對(duì)照組腎上腺皮質(zhì)束狀帶萎縮明顯，結(jié)構(gòu)紊亂消失、輪廓模糊不清(圖1B)；治療組腎上腺皮質(zhì)束狀帶與對(duì)照組相比有不同程度的增生，可見(jiàn)該區(qū)細(xì)胞核增多明顯，但結(jié)構(gòu)較正常組紊亂(圖1C)。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠血清皮質(zhì)醇、ACTH水平比較

注：與正常組相比，aP<0.05；與對(duì)照組相比，bP<0.05；與實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)相比，cP<0.05；與實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)2周時(shí)相比，dP<0.05。

表2 實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)4周時(shí)各組大鼠體質(zhì)量、垂體及腎上腺質(zhì)量和臟器指數(shù)比較( x±s)

注：與正常組相比，aP<0.05；與對(duì)照組相比，bP<0.05。

注：A為正常組，B為對(duì)照組，C為治療組。

圖1 大鼠腎上腺病理圖像(HE染色)

3 討論

目前GC仍然是PNS的一線(xiàn)治療藥物，但是長(zhǎng)期大劑量使用GC出現(xiàn)的一系列不良反應(yīng)[6]引起了學(xué)者們的重視，尤其是GC對(duì)患兒HPA軸抑制的研究日漸增多。國(guó)內(nèi)研究[7]發(fā)現(xiàn)，不同中效GC對(duì)非頻繁復(fù)發(fā)PNS患兒血清皮質(zhì)醇水平有影響，其中潑尼松對(duì)垂體功能的抑制作用較曲安西龍及甲潑尼龍持久。臨床上ACTH已用于慢性濕疹[8]、嬰兒痙攣[9～11]、晶狀體性關(guān)節(jié)炎[12]等疾病的治療，并有很好的療效，且比較安全。近年ACTH在治療腎病中的研究也較多，如在特發(fā)性膜性腎小球腎炎[13]、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)[14]和免疫抑制劑治療失敗的難治性腎病[15]及其他腎小球疾病[16]中的應(yīng)用呈現(xiàn)了一定的治療效果。因此，ACTH減輕GC對(duì)HPA軸的抑制作用，為臨床PNS患兒GC應(yīng)用中減少頻繁復(fù)發(fā)和激素依賴(lài)的發(fā)生率是有意義的。

文獻(xiàn)[17,18]報(bào)道非頻繁復(fù)發(fā)PNS患兒在GC誘導(dǎo)緩解期即大劑量GC持續(xù)應(yīng)用的過(guò)程中，血清皮質(zhì)醇水平下降明顯，對(duì)HPA軸有明顯的抑制作用，這是PNS患兒出現(xiàn)頻繁復(fù)發(fā)和激素依賴(lài)的重要原因之一。在本研究中，實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)2周時(shí)，與正常組相比，對(duì)照組和治療組大鼠的血清皮質(zhì)醇及ACTH水平明顯降低，且與同組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)相比亦明顯降低，表明大劑量的醋酸潑尼松應(yīng)用早期對(duì)大鼠HPA軸就有明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)4周時(shí)，即ACTH治療2周后，治療組大鼠的血清皮質(zhì)醇及ACTH水平明顯高于對(duì)照組，且較治療前升高明顯；治療組大鼠的垂體、腎上腺質(zhì)量及臟器指數(shù)與對(duì)照組相比升高亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；病理檢查結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，治療組大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶增生明顯。ACTH治療過(guò)程中無(wú)明顯不良反應(yīng)。上述結(jié)果表明ACTH應(yīng)用2周即可明顯促進(jìn)大鼠內(nèi)源性皮質(zhì)醇和ACTH的分泌，在一定程度上促進(jìn)垂體和腎上腺的增生，并且能夠改善腎上腺皮質(zhì)束狀帶的萎縮情況。研究[19]發(fā)現(xiàn)，PNS頻繁復(fù)發(fā)及激素依賴(lài)患兒應(yīng)用ACTH有一定療效，可避免長(zhǎng)期GC治療的不良反應(yīng)，其機(jī)制可能與ACTH減輕GC對(duì)HPA軸的抑制作用有關(guān)。因此，臨床上在應(yīng)用大劑量GC治療PNS早期即給予ACTH，可能會(huì)降低PNS患兒頻復(fù)發(fā)和激素依賴(lài)的發(fā)生率。

本研究對(duì)大鼠垂體的病理觀察不是很理想，這可能與實(shí)驗(yàn)的周期較短，垂體病理改變不顯著有關(guān)。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)治療組大鼠的體質(zhì)量與對(duì)照組相比增長(zhǎng)不明顯，這可能與ACTH減輕大劑量GC的不良反應(yīng)、抑制脂肪的合成和重新分布有關(guān)。

總之，本研究從功能和形態(tài)兩方面進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)大劑量GC應(yīng)用過(guò)程中早期給予ACTH能夠促進(jìn)大鼠垂體及腎上腺皮質(zhì)束狀帶的增生和分泌，減輕大劑量GC對(duì)大鼠HPA軸的抑制作用。今后可進(jìn)一步以PNS患兒作為觀察對(duì)象進(jìn)行相關(guān)研究。

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Functional and pathological changes of HPA axis of rats in the early-stage application of ACTH during the process of using a large dose of glucocorticoid

YANGLixiao1,ZHANGBili,WANGWenhong

(1GraduateSchoolofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Objective To observe the functional and pathological changes of hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis of rats in the early-stage application of adrenocorticotropic hormone (ACTH) during the process of using a large dose of glucocorticoid (GC).Methods Thirty male Wistar rats were randomly divided into the normal group, control group and ACTH treatment group, 10 rats in each group. Rats of the normal group were given distilled water by gavage for 2 weeks. Rats of the control group and ACTH treatment group were treated with high dose of prednisone acetate in aqueous solution by gavage for 2 weeks. After that, the ACTH treatment group was treated with subcutaneous injection of ACTH for 2 weeks, and the other two groups were treated with the same treatment as before. The levels of cortisol and ACTH in serum were measured respectively at the beginning of the experiment, at the end of 2 and 4 weeks after the experiment. When the experiment was over 4 weeks, the rats were killed, the quality of the pituitary and adrenal glands were measured, the pathological changes were observed, and organ index was calculated.Results At the beginning of the experiment, there was no difference in the serum cortisol and ACTH between the groups (P>0.05). At the end of 2 weeks after the experiment, there was no significant difference in serum cortisol and ACTH between the control group and the ACTH treatment group (P>0.05). At the end of 4 weeks after the experiment, the serum cortisol and ACTH levels in the ACTH treatment group were higher than those in the control group (allP<0.05), and the quality of pituitary, adrenal gland and organ index were higher than those of the control group (allP<0.05). At the end of 4 weeks after the experiment, no significant changes were found in the distal part of the pituitary of rats in each group. And the structure of adrenal cortex zona of rats in the normal group was clear. The structure of adrenal cortex zona of the control group was thinning and disordered as compared with that of the normal group. The structure of adrenal cortex zona of the ACTH treatment group was thickening and the nucleus increased at different degrees as compared with that of the control group, but it arranged in disorder as compared with that of the normal group.Conclusion Early application of ACTH in the process of using high dose GC can reduce the inhibitory effect of GC on HPA axis in rats, accelerate the adrenal cortex zona secretion, promote the proliferation of pituitary and adrenal gland, and improve the adrenal cortex zona atrophy in pathology significantly.

adrenocorticotropic hormone; glucocorticoid; hypothalamic-pituitary-adrenal axis; primary nephrotic syndrom; animal experiment

天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合科研專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(13127)。

楊麗瀟(1988-)，女，碩士研究生在讀，主要研究方向?yàn)閮嚎茖W(xué)。E-mail： 15369313972@163.com

簡(jiǎn)介：張碧麗(1959-)，女，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樾耗I臟疾病。Email： zhangbili218@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.007

R725

A

1002-266X(2016)43-0022-04

2016-05-14)