萬古霉素依賴性屎腸球菌的生物學特性觀察

韓清珍，徐杰，張險峰，錢雪峰，章楊，史進方，仇惠英

(1蘇州大學附屬第一醫院臨床檢測中心，江蘇蘇州215006；2蘇州大學附屬第一醫院江蘇省血液病研究所)

萬古霉素依賴性屎腸球菌的生物學特性觀察

韓清珍1,2，徐杰1，張險峰1，錢雪峰1，章楊1，史進方1，仇惠英2

(1蘇州大學附屬第一醫院臨床檢測中心，江蘇蘇州215006；2蘇州大學附屬第一醫院江蘇省血液病研究所)

目的 觀察萬古霉素依賴性屎腸球菌(VDEfm-1501)的生物學特性。方法 1株從1例血液病患者尿液中分離到的依賴萬古霉素生長的VDEfm-1501，先用VITEK 2細菌鑒定儀對其進行菌種鑒定，之后用PCR法和VITEK MS質譜鑒定法對其進一步驗證。E-test法檢測VDEfm-1501萬古霉素依賴生長特性及生長所需的最低萬古霉素濃度；K-B法檢測VDEfm-1501耐藥性；PCR法檢測VDEfm-1501耐藥基因；多位點序列分型法對VDEfm-1501進行序列型(ST)分型；PCR法對VDEfm-1501的D-丙氨酸連接酶基因(ddl基因)進行測序。結果 隨著VDEfm-1501傳代次數增多其萬古依賴性逐漸減弱，傳至第5代時這種依賴性不再明顯，第6代時幾乎完全消失； VDEfm-1501正常生長至少需要1.0 μg/mL的萬古霉素。VDEfm-1501對氨芐青霉素、慶大霉素及環丙沙星耐藥，僅對利奈唑胺和四環素敏感；VDEfm-1501攜帶慶大霉素耐藥基因[ace(6′)-Ie-aph(2″)-la基因]。VDEfm-1501為耐萬古霉素的腸球菌(VRE)ST型，屬于CC17克隆復合體。VDEfm-1501的ddl基因942 bps位置上插入了“GG”。結論 VDEfm-1501依賴萬古霉素生長的特性容易丟失，其生長所需的最低萬古霉素濃度為1.0 μg/mL。VDEfm-1501多重耐藥，攜帶耐藥基因ace(6′)-Ie-aph(2")-la基因。VDEfm-1501屬于VRE的ST型。ddl基因942 bps位置上“GG”的插入導致了VDEfm-1501的出現。

腸球菌；耐萬古霉素的腸球菌；萬古霉素依賴性腸球菌；屎腸球菌；萬古霉素依賴性屎腸球菌；萬古霉素；替考拉寧

萬古霉素依賴性腸球菌(VDE)是指只有在萬古霉素、替考拉寧等糖肽類抗生素存在的條件下才能生存的腸球菌，由耐萬古霉素的腸球菌(VRE)突變而來。自1994年全球第1株VDE被報道以來[1]，先是美國、英國等發達國家報道[2]檢出VDE；近十幾年來相繼在印度、巴西等發展中國家也分離到了VDE[3,4]；近幾年隨著糖肽類抗生素的廣泛使用，VRE的檢出率不斷上升[5]。但到目前為止在我國還未見有關VDE的詳細報道。2015年6月，我們從1例血液病患者的尿液中培養分離到了1株依賴萬古霉素生長的屎腸球菌，命名為VDEfm-1501。我們對這株VDEfm-1501鑒定后，觀察了其物學特性?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 VDEfm-1501來自1例血液病患者的尿液，該患者為51歲女性，患骨髓增生異常綜合征，2015年6月20日因血細胞三系進行性下降由外院轉入蘇州大學附屬第一醫院。該患者入院前因發熱靜脈滴注亞胺培南11 d、替考拉寧6 d；本次入院后第1天的尿常規檢查提示白細胞(109/μL)升高(正常為0～28/μL)，疑為尿路感染，第2天送檢尿培養，同時靜脈滴注頭孢地嗪和左氧氟沙星、口服制霉素片；6月26日尿常規檢查結果恢復正常后停用左氧氟沙星，制霉素片和頭孢地嗪作為預防用藥一直沿用至7月15日；6月26日尿培養發現了VDEfm-1501。

1.1.2 試劑和儀器 哥倫比亞血瓊脂平板，巧克力血瓊脂平板，MH藥敏試驗瓊脂平板，藥敏紙片，自制菌株保藏基質，甘油與蒸餾水混合配制15%甘油，核酸提取和純化試劑盒，Taq酶、DNA marker DL2000及其他PCR相關試劑。PCR引物合成、基因測序由上海生工生物工程有限公司完成。VITEK 2細菌鑒定儀，GeneAmp PCR System 9700 PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 VDEfm-1501的鑒定及其抗生素敏感性試驗 利用VITEK2細菌鑒定儀對VDEfm-1501進行鑒定，同時利用K-B法進行抗生素敏感性試驗，質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923(紙片擴散法藥敏試驗的質控菌株)。之后，用PCR法和VITEK MS質譜鑒定法進一步對VDEfm-1501進行驗證。PCR簡要步驟：用PCR試劑盒提取VDEfm-1501的核酸作為模板，借助屎腸球菌(E. faecium)和糞腸球菌(E. faecalis)的特異性鑒定引物用PCR方法進一步驗證[6]。

1.2.2 VDEfm-1501萬古霉素依賴生長特性及生長需要的最低萬古霉素濃度觀察 挑取VDEfm-1501菌落，配備0.5麥氏濁度的菌液，涂布法將其接種于MH藥敏試驗瓊脂平板，貼萬古霉素紙片驗證其萬古霉素依賴生長特性，并觀察傳代第3、4、5、6次的VDEfm-1501是否依然聚集在萬古霉素紙片周圍生長，判斷其萬古霉素依賴生長特性的穩定性；同時利用萬古霉素E-test紙條檢測VDEfm-1501生長需要的最低萬古霉素濃度。

1.2.3 VDEfm-1501耐藥性觀察及耐藥基因檢測 K-B法檢測VDEfm-1501耐藥性，參照 CLSI 2015抗菌藥物敏感性試驗紙片法執行標準初步判定其耐藥情況。采用PCR法檢測 VDEfm-1501的耐藥基因，包括糖肽類耐藥基因(vanA、vanB基因)、慶大霉素耐藥基因[(ace(6′)-Ie-aph(2″)-la基因]、四環素類耐藥基因(tetM基因)和金黃色葡萄球菌β-內酰胺酶類耐藥基因(tem基因)[7]。

1.2.4 VDEfm-1501的分型 采用多位點序列分型(MLST)法。提取VDEfm-1501基因組DNA，PCR法分別擴增7個管家基因，即腺苷酸激酶基因(adk基因)、ATP合成酶α亞基基因(atpA基因)、D-丙氨酸連接酶基因(ddl基因)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因(gdh基因)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gyd基因)、磷酸腺苷結合盒轉運體基因(pstS基因)、磷酸核糖胺咪唑羧化酶基因(purk基因)[8]。PCR產物雙向測序，產物序列與屎腸球菌MLST數據庫(http://efaecium.mlst.net/)數據比對，依次獲得等位基因號、序列型(ST)。

1.2.5 VDEfm-1501的ddl基因突變分析 以Enterococcus faecium DO(NC_017960.1，VRE)基因組序列為參考，在ddl基因編碼框外側設計特異性引物ddl-O-F(5′-TGAACGATTTAGAATACAG-3′)、ddl-O-R(5′-ACGCAATCACTCCAGCCTC-3′)，以提取的VDEfm-1501 DNA為模板，擴增ddl基因(1 141 bps)，PCR產物雙向測序，產物序列與美國國立生物信息中心數據庫(https://blast.ncbi.nlm.nihgov/Blast.cgi)數據比對。PredictProte(https://www.predictprotein.org/)生物信息軟件預測ddl蛋白的結構。

2 結果

2.1 VDEfm-1501的鑒定結果 患者尿液接種過夜后，在血平板上發現了二十幾個類似腸球菌的菌落，VITEK 2鑒定為屎腸球菌，K-B法藥物敏感性試驗顯示該菌圍繞萬古霉素和替考拉寧紙片聚集生長，遠離這兩種紙片的部位幾乎無該菌生長。PCR法和VITEK MS質譜鑒定儀鑒定結果均為屎腸球菌。

2.2 VDEfm-1501萬古霉素依賴生長特性及生長需要的最低萬古霉素濃度 VDEfm-1501在普通血平板上生長很差，菌落小且分布稀疏；VDEfm-1501在含萬古霉素的巧克力平板上可以正常生長；VDEfm-1501在MH藥敏平板上只圍繞萬古霉素或者替考拉寧紙片生長。在缺少萬古霉素的血平板上，隨著傳代次數增加，VDEfm-1501的萬古依賴性逐漸減弱；傳至第3代時菌落主要圍繞萬古霉素和替考拉寧紙片周圍生長，在遠離紙片處只有稀疏的菌落；傳至第4代時仍然可以看出萬古霉素紙片周圍菌落密度高于遠離紙片的部位，第5代時這種特性不再明顯，第6代時這種特性幾乎完全失去，在缺少萬古霉素的條件下VDEfm-1501可以正常生長。VDEfm-1501正常生長至少需要1.0 μg/mL的萬古霉素。

2.3 VDEfm-1501的耐藥性及其耐藥基因 VDEfm-1501除了對糖肽類抗生素萬古霉素和替考拉寧耐藥外，同時對多種抗生素(包括青霉素類的氨芐青霉素、氨基糖苷類的慶大霉素以及第三代喹諾酮類的環丙沙星)耐藥，僅對利奈唑胺和四環素敏感。VDEfm-1501屬于vanA型VRE，同時攜帶耐藥基因ace(6′)-Ie-aph(2″)-la基因(見圖1)。

注：aph即ace(6′)-Ie-aph(2″)-la基因

圖1 VDEfm-1501耐藥基因PCR產物電泳圖

2.4 VDEfm-1501分型 VDEfm-1501的7個管家基因atpA、ddl、gdh、purk、gyd、pstS、adk基因的等位基因號分別為15、1、1、1、1、1、1，ST型為ST78，是VRE常見的ST型，屬于CC17克隆復合體。

2.5 VDEfm-1501的ddl基因突變情況 與Enterococcus faecium DO參考基因組相比，VDEfm-1501的ddl基因在942 bps處有一個“GG”插入，“GG”的插入導致ddl蛋白在C端發生了一個16個氨基酸移碼和28個氨基酸缺失的突變(見圖2)。

圖2 VDEfm-1501 的ddl基因突變(A)和預測ddl蛋白的結構(B)

3 討論

由于VRE的泛耐藥性、缺少有效藥物以及復雜的耐藥機制，造成治療手段非常有限[9]。而VDE的出現給腸球菌感染的診斷和治療帶來了更大的困難和挑戰。國內萬古霉素、替考拉寧等糖肽類抗生素的使用非常普遍，很容易導致萬古霉素敏感型腸球菌(VSE)到VRE及VDE的突變。VDE的發現有兩種途徑：一是在利用含萬古霉素的培養基進行VRE篩查過程中發現[4]；二是在普通血平板(不含萬古霉素)中偶然分離到幾個稀疏分布、長勢很差的疑似腸球菌菌落，在后續的K-B紙片擴散法進行耐藥性檢測時發現菌落只圍繞萬古霉素紙片生長，而在普通血平板中繼續傳代培養非常難，仔細鑒定后確定為VDE[1]。VDEfm-1501的發現過程即屬于第二種情況，可能是在患者尿液中殘留的萬古霉素幫助下，我們才能在原始平板中分離到幾個長勢較差的菌落，又得益于K-B紙片擴散法才發現其圍繞萬古霉素紙片生長的特性。但是，在國內很多大型醫院的微生物診斷室傾向用MIC法檢測細菌耐藥性，即使恰巧分離到幾個VDE菌落，如果沒有相關的知識和相應的技術很容易失去檢出VDE的機會。

VDE感染的實驗室診斷很明確，在萬古霉素存在條件下才能正常生長的營養缺陷型腸球菌即可鑒定為VDE，但在接種、分離、鑒定過程中要注意以下幾點：①對血液科、ICU等科室所有送檢的細菌培養標本，要常規接種含萬古霉素的巧克力平板及進行萬古霉素紙片試驗；②對近期有萬古霉素使用史的患者和應用萬古霉素治療無效的患者的標本，如分離到少量腸球菌，不能主觀判斷為非致病菌或污染菌而失去檢出VDE的機會，因為VDE有時候可能在標本殘留的萬古霉素作用下少量生長，本研究中的VDEfm-1501在患者尿液中檢測到的數量僅為4 000 cfu/mL，遠小于有臨床意義的105cfu/mL，很容易漏檢；③VDE屬于較難培養的缺陷型細菌，使用快速生化儀和傳統的生化反應鑒定菌種，以及使用紙片法或者MIC法進行耐藥性檢測時，均要添加萬古霉素或者D-alanine-D-alanine[1]，有條件的實驗室可以使用質譜法或PCR法進行菌種鑒定。

我們分離的這株VDEfm-1501為ST78，屬于常見的CC17克隆復合體，蘇州大學附屬第一醫院中流行的VRE也是這個克隆群，推測VDEfm-1501可能是由VRE突變而來。VDE仍有很強的致病性，且仍保留了范耐藥性，不易根除。VDEfm-1501攜帶膠質黏附素基因(acm基因)和明膠酶基因(gelE基因)兩個毒力基因，同時對青霉素類、氨基糖苷類、喹諾酮類等多種抗生素耐藥，直接證實了VDE的潛在致病性和泛耐藥性。但VDE感染的治療對策與VRE不同，一旦確診應立即停止使用萬古霉素等糖肽類抗生素[10]。本株VDEfm-1501來源者停用替考拉寧后尿路感染得到控制，其后續標本中未再檢出腸球菌。僅停用萬古霉素是否合理還需要更多研究證實，因為包括VDEfm-1501在內的VDE很容易突變回VRE，患者有可能是VRE和VDE的混合感染，或者交替感染[11]。對此有學者[12]建議停用萬古霉素的同時，還要根據菌種和感染部位適當選用利奈唑胺、達托霉素和奎奴普汀。

萬古霉素主要是通過與肽聚糖前體末端的D-alanine-D-alanine結合而抑制腸球菌細胞壁的合成。VRE因為肽聚糖前體的D-alanine-D-alanine被其他形式(如D-alanyl-D-lactate，vanA型VRE)取代，使其與糖肽類抗生素親和力下降而產生耐藥。VSE只能合成正常的末端為D-alanine-D-alanine的肽聚糖，VRE不僅能合成以D-alanyl-D-lactate為末端的替代形式的肽聚糖，也保留了合成正常肽聚糖的能力，因此VRE在有無萬古霉素的條件下都可以生長。VDE菌株合成D-丙氨酸連接酶的ddl基因發生了突變，失去了合成正常肽聚糖前體的能力，只能依賴萬古霉素誘導形成的另一種連接酶(vanA 或 vanB)合成以D-alanyl-D-lactate為末端的替代形式的肽聚糖。所以從VRE到VDE主要是由于ddl基因突變導致D-alanine-D-alanine 連接酶功能受損[4, 11～13]。VDEfm-1501的ddl基因一個“GG”的插入，引起DDL蛋白的二級結構、螺旋、疏水性、結構域等發生改變，喪失了原有功能，從而導致萬古霉素耐藥表型的改變，變成VDE。

從VSE到VRE到VDE的發展，無疑是在糖肽類抗生素作用下發生的，但在臨床感染病例中，腸球菌是惟一一種呈現依賴抗生素生長特性的細菌，所以要重視VRE和VDE的防控。隨著萬古霉素等糖肽類抗生素應用越來越多，國內可能會有更多VDE出現，這對腸球菌感染的實驗室診斷和治療提出了挑戰。

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Biological characteristics of vancomycin-dependent enterococcus faecium

HANQingzhen1,XUJie,ZHANGXianfeng,QIANXuefeng,ZHANGYang,SHIJinfang,QIUHuiying

(1ClinicalTestingCenter,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,China)

Objective To observe the biological characteristics of a vancomycin-dependent enterococcus faecium (VDEfm-1501).Methods A strain of VDEfm-1501 was isolated from an urine specimen of a woman with blood system disease and was identified by VITEK 2, followed by PCR and VITEK MS. The VDEfm-1501 vancomycin-dependent growth characteristics and the minimum vancomycin concentration required for growth were tested by E-test. Its antibiotic resistance was analyzed by K-B disc diffusion. Drug resistance and virulence genes were amplified by PCR. The multilocus sequence typing (MLST) was applied in the sequence typing. Ddl sequencing of VDEfm-1501 was detected by PCR. Results VDEfm-1501 could only grow on the presence of 1.0 μg/mL vancomycin at least, but such characteristic could weaken with the increase of passage times, and no vancomycin-dependence was found in the sixth passage. VDEfm-1501 showed multi-drug resistance except linezolid and tetracycline, and carried resistant gene of ace(6')-Ie-aph(2")-la. VDEfm-1501 belonged to clonal complex 17 (CC17), which was the cause of most of the nosocomial VRE outbreaks globally. And its vancomycin dependence seemed to be associated with the insertion of 'GG' at nucleotide position 942 of the ddl gene.Conclusions The growth of VDEfm-1501 needs at least 1 μg/mL vancomycin, but such dependence is easy to lose. VDEfm-1501 displays multi-drug resistance and carrys the resistant gene of ace(6')-Ie-aph(2")-la. VDEfm-1501 belongs to ST of VRE. The insertion of 'GG' leads to the emergence of VDEfm-1501.

enterococcus; vancomycin-resistant enterococci; vancomycin-dependent enterococci; enterococcus faecium; vancomycin-dependent enterococcus faecium; vancomycin; teicoplanin

國家自然科學基金青年科學基金資助項目(81501425)；江蘇省蘇州市“科教興衛”青年科技項目(kjxw2014008)。

韓清珍(1984-)，女，助理研究員，主管檢驗師，主要研究方向為感染性疾病的實驗室診斷。E-mail: gyhqz02@163.com

簡介：仇惠英(1966-)，女，主任醫師，主要研究方向為血液病的診治及血液病患者感染的防治。E-mail: qiuhuiying@aliyun.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.008

R446.5

A

1002-266X(2016)43-0026-04

2016-07-06)