丙泊酚靜脈泵注對兔脊髓缺血再灌注損傷的防治作用及其機制

解立杰，黃錦秀，胡霽

(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院，武漢430077)

丙泊酚靜脈泵注對兔脊髓缺血再灌注損傷的防治作用及其機制

解立杰，黃錦秀，胡霽

(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院，武漢430077)

目的 觀察丙泊酚靜脈泵注對兔脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)的防治作用，并探討其作用機制。方法 用隨機數字表法將36只日本大耳白兔分為假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(IR組)、IR+丙泊酚處理組(IR+P組)，各12只；每組設兩個觀察時間點，分別為再灌注24 h和48 h，每個時點觀察6只。Sham組游離暴露腹主動脈(不阻斷)，IR組和IR+P組動脈夾夾閉腹主動脈30 min建立SCIRI模型；IR+P組于主動脈夾閉前10 min和再灌注即刻分別以微量泵持續靜脈泵注丙泊酚(30 mg/kg溶于30 mL生理鹽水，輸注速度3 mL/min)，其余兩組在相同時間點以相同的容量、速度泵注生理鹽水。三組動物分于術后24 h和48 h按Tarlov評分標準行后肢神經功能評分，然后處死并取其L4～L6段脊髓組織，觀察病理變化，用Western blotting和RT-PCR分別檢測脊髓組織中腦源性神經營養因子(BDNF)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PKC)ε的蛋白及mRNA。結果 同一時間點，與IR組相比，IR+P組后肢神經功能評分明顯增高(P<0.05)，脊髓損傷減輕，脊髓組織BDNF、PKCε的蛋白及mRNA表達明顯升高(P均<0.05)。結論 丙泊酚靜脈泵注對兔SCIRI有一定的防治作用，其作用機制可能是丙泊酚激活了PKCε/PKC信號通路，上調了BDNF的表達。

丙泊酚；脊髓缺血；再灌注損傷；腦源性神經營養因子；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶ε

脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)是胸腹主動脈修復術、胸腹主動脈瘤手術中常見的并發癥。在胸腹主動脈修復術中，SCIRI的發生率高達32%[1]。SCIRI引起的一個嚴重的并發癥是截癱。有效防治SCIRI是臨床工作中亟需解決的問題。丙泊酚是常用的靜脈麻醉藥，主要用于麻醉和鎮靜。有研究[2]證實丙泊酚對腦及脊髓損傷有一定的修復作用。腦源性神經營養因子(BDNF)對神經具有保護作用，在SCIRI過程中，增加脊髓組織中BDNF表達可以明顯改善SCIRI的預后[3]，蛛網膜下腔注入BDNF對脊髓組織損傷亦具有顯著的修復作用[4]。2015年8月20日～2016年4月20日，我們觀察了丙泊酚靜脈泵注對兔SCIRI的防治作用，并探討了其作用機制。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器 丙泊酚。BDNF、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PKC)ε一抗，BCA蛋白定量檢測試劑盒，TRIzol試劑，反轉錄試劑盒。微量泵，離心機，熒光定量PCR儀，紫外分光光度計，蛋白質灰度分析軟件。

1.2 實驗動物及其分組 雄性日本大耳白兔36只，體質量2.0～2.5 kg，用隨機數字表法將其分為假手術組(Sham組)、缺血再灌注損傷組(IR組)、IR+丙泊酚處理組(IR+P組)，各12只；每組設兩個研究時點，分別為再灌注24 h和48 h，每個時點觀察6只。實驗前所有動物神經系統完好無損，后肢運動功能正常。

1.3 各組實驗動物的處理及丙泊酚給予方法 各組實驗動物禁食12 h(自由飲水)后3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉，保留自主呼吸，同時耳緣靜脈持續輸注復方乳酸鈉林格液6 mL/(kg·h)，持續監測體溫，加熱毯維持動物體溫(38.5±0.5) ℃，股動脈置管監測遠端血壓。Sham組游離暴露腹主動脈(不阻斷)，IR組和IR+P組動脈夾夾閉腹主動脈30 min建立SCIRI模型；IR+P組于主動脈夾閉前10 min和再灌注即刻分別以微量泵持續靜脈泵注丙泊酚(30 mg/kg溶于30 mL生理鹽水，輸注速度3 mL/min)，其余兩組在相同時間點以相同的容量、速度泵注生理鹽水。所有動物在手術操作完成后，4萬U青霉素肌注預防術后感染，0.25%布比卡因局部浸潤鎮痛，回籠飼養。

1.4 各組實驗動物后肢神經功能評價 再灌注24、48 h時由一位未參與實驗動物分組的研究人員對各組各6只動物進行后肢功能評分，評分采用改良Tarlov脊髓損傷評分標準[5]：截癱、后肢沒有運動能力為0分；后肢有微弱的運動功能、微弱的抗重力能力為1分；后肢有較好的抗重力功能但不能拖動為2分；后肢能夠拖動，可跳躍，但沒有恢復正常為3分；后肢運動功能正常為4分。

1.5 各組實驗動物脊髓組織病理學檢查 再灌注24、48 h時，后肢神經功能評分結束即刻處死動物(各組各6只)，取其L4～L6段脊髓組織，4%甲醛浸泡固定，脫水，石蠟包埋，橫斷面厚度4 μm切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察脊髓組織的形態：損傷的神經元表現為細胞核固縮或溶解，胞質呈嗜伊紅染色，胞質中尼氏體減少或消失及神經元周圍有空泡形成；正常神經元表現為多角形結構，胞核結構清晰，胞質中尼氏體存在。

1.6 各組實驗動物脊髓組織中BDNF、PKCε蛋白檢測 采用Western blotting法。取脊髓組織標本，冰上裂解、勻漿，12 000 g離心5 min，取上清液，即總蛋白液，BCA法測定蛋白濃度。等量蛋白樣品上樣，經12%的SDS-PAGE電泳分離后，電轉移至硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶封閉后分別加入BDNF、PKCε一抗(1∶1 000 稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗后加入1∶3 000酶標記羊抗小鼠二抗稀釋液，室溫下孵育30 min，室溫下用TBST緩沖液在脫色搖床上洗3次，每次5 min。增強化學發光反應，曝光、顯影、定影。凝膠成像系統觀察，Alpha軟件分析目標蛋白條帶的光密度值，GAPDH作內參，目標蛋白條帶光密度值與內參條帶光密度值的比值標化后表示目標蛋白的相對表達量。

1.7 各組實驗動物脊髓組織中BDNF、PKCε mRNA檢測 采用RT-PCR法。用TRIzol試劑提取受檢脊髓組織總mRNA。按照反轉錄試劑盒說明對RNA樣本進行逆轉錄獲得cDNA。BDNF引物序列：上游5′-CAACGAAGAAAACAATAAGGACGC-3′,下游5′-CGCCGGACCCTCATAGACAT-3′；PKCε引物序列：上游5′-TGGCGTCTCAGAACTGCTCAAG-3′，下游5′-CGCACCCGCTCATACAACTC-3′；GAPDH引物序列：上游5′-CGCCTGGAGAAAGCTGCTA-3′，下游5′-ACGACCTGGTCCTCGGTGTA-3′；擴增片段長度分別為147、165、104 bp。PCR反應體系的配制、反應參數等均按Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)試劑盒說明進行；反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，72 ℃、20 s，40個循環。將2-ΔΔCt值標化后表示目標mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 再灌注24、28 h時各組實驗動物后肢神經功能評分比較 實驗前所有兔子后肢運動功能正常。再灌注24、48 h時，IR+P組、IR組后肢神經功能評分與Sham組相比，P均<0.05；兩個時間點IR+P組后肢神經功能評分與IR組相比，P均<0.05。結果詳見表1。

表1 再灌注24、28 h時三組實驗動物后肢神經功能

2.2 各組實驗動物脊髓組織病理學變化 Sham組再灌注24、48 h時脊髓組織神經元結構完整，輪廓完整，核圓，胞質飽滿，核仁清晰(見圖1A、D)。IR組再灌注24 h時脊髓組織部分神經元固縮、核溶解、尼氏體明顯減少(見圖1B);再灌注48h時神經元結構嚴重破壞，胞核大量溶解，幾乎見不到正常運動神經元，部分神經細胞周圍可見較多空泡形成(見圖1E)。IR+P組再灌注24、48 h時脊髓組織神經元病理變化明顯輕于IR組，部分脊髓神經元輕度萎縮，核仁輕度萎縮，少有胞核顏色變淡、消失，細胞腫脹、少許空泡形成，組織損傷明顯減輕(見圖1C、F)。

注：A:Sham組，再灌注 24 h；B:IR組，再灌注24 h；C:IR+P組，再灌注24 h；D: Sham組，再灌注48 h；E: IR組，再灌注48 h；F: IR+P組，再灌注48 h。

圖1 各時間點各組脊髓組織病理形態(HE染色，400×)

2.3 各組實驗動物脊髓組織BDNF、PKCε蛋白的表達比較 再灌注24、48 h時，各組實驗動物脊髓組織BDNF、PKCε蛋白的表達比較見表2。

表2 再灌注24、48 h時各組實驗動物脊髓組織BDNF、PKCε蛋白的相對表達量比較±s)

注：與Sham組相比，#P<0.05;與IR組相比，*P<0.05。

2.4 各組實驗動物脊髓組織BDNF、PKCε mRNA的表達比較 再灌注24、48 h時各組實驗動物脊髓組織BDNF、PKCε mRNA的表達比較見表3。

表3 再灌注24、48 h時各組實驗動物脊髓組織BDNF、PKCε mRNA的相對表達量比較

注：與Sham組相比，#P<0.05;與IR組相比，*P<0.05。

3 討論

本研究結果顯示，IR+P組兔的神經功能評分明顯增高、脊髓損傷明顯減輕，說明丙泊酚靜脈泵注對兔SCIRI有一定的防治作用。

BDNF作為神經營養因子家族的成員之一，廣泛分布于中樞神經系統，在中樞神經系統發育過程中對神經元的生長、分化和維持其正常的生理功能起著關鍵作用[6]。有研究[7]發現，BDNF與腦組織缺血缺氧損傷有著密切的關系，BDNF能夠抑制神經元細胞凋亡，對缺血損傷的腦細胞有一定的保護作用[8]。BDNF在脊髓損傷的發生發展過程中也扮演著極其重要的角色，同時BDNF極有可能對脊髓機械性和缺氧性損傷具有良好的的治療作用[9]。在大鼠SCIRI過程中，增加其脊髓組織中BDNF表達可以明顯改善大鼠的預后[3]，同時蛛網膜下腔注入BDNF對損傷脊髓組織亦具有保護作用[4]。有研究[10]發現，丙泊酚可以促進大鼠腦海馬組織BDNF的表達，對小鼠腦慢性缺血性損傷具有改善作用。本研究結果顯示，丙泊酚靜脈泵注后，SCIRI兔的脊髓組織中BDNF表達明顯增多。我們推測丙泊芬通過改變BDNF的表達對脊髓組織產生了一定的保護作用，從而減輕了脊髓組織的損傷。

PKC廣泛分布于哺乳動物的組織和細胞中，對細胞的生長代謝、增殖分化等發揮重要作用。 PKCε 是PKC的一個亞型。Neumann等[11]發現，用PKCε 預處理可以增加大鼠腦組織BDNF的表達。也有研究[12]證實，丙泊酚對大腦皮質神經元中的PKCε 具有一定的激活作用。本研究發現，給予丙泊酚后，SCIRI兔的脊髓組織中PKCε 表達明顯增加，這可能是丙泊酚減輕脊髓損傷的機制之一。

綜上所述，丙泊酚靜脈泵注對兔SCIRI有一定的防治作用，其作用機制可能是丙泊酚激活了PKCε /PKC信號通路，PKCε 表達增加，進一步促進了BDNF的表達。這一研究結果為臨床防治SCIRI提供了新的思路。

[1] Panthee N, Ono M. Spinal cord injury following thoracic and thoracoabdominal aortic repairs [J]. Asian Cardiovasc Thorac Ann, 2015,23(2):235-246.

[2] Yu Q, Hu J, Yang J, et al. Protective effect of propofol preconditioning and postconditioning against ischemic spinal cord injury [J]. Neural Regen Res, 2011,6(12):951-955.

[3] Wang Y, Su R, Lv G, et al. Supplement Zinc as an effective treatment for spinal cord ischemia/reperfusion injury in rats [J]. Brain Res, 2014,1545(4):45-53.

[4] Novikova LN, Novikov LN, Kellerth JO. Survival effects of BDNF and NT-3 on axotomizedrubrospinal neurons depend on the temporal pattern of neurotrophin administration [J]. Eur J Neurosci, 2000,12 (2):776-780.

[5] Fang B, Li X, Sun X, et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption [J]. Int J Mol Sci, 2013,14(5):10343-10354.

[6] Wenjin W, Wenchao L, Hao Z, et al. Electrical stimulation promotes BDNF expression in spinal cord neurons through Ca2+and Erk-dependent signaling pathways [J]. Cell Mol Neurobiol, 2011,31(3):459-467.

[7] Sendtner M, Pei G, Beck M, et al. Developmental motoneuron cell death and neurotrophic factors[J]. Cell Tissue Res, 2000,301(1):71-84.

[8] Zhao J, Xu H, Tian Y, et al. Effect of electroacupuncture on brain-derived neurotrophic factor mRNA expression in mouse hippocampus following cerebral ischemia-reperfusion injury [J]. J Tradit Chin Med, 2013,33(2):253-257.

[9] Weishaupt N, Blesch A, Fouad K. BDNF: the career of a multifaceted neurotrophin in spinal cord injury [J]. Exp Neurol, 2012,238(2):254-264.

[10] Chen G, Fu Q, Cao J, et al. Effect of propofol on brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase receptor B in the hippocampus of aged rats with chronic cerebral ischemia [J]. Neural Regen Res, 2012,7(21):1645-1649.

[11] Neumann JT, Thompson JW, Raval AP, et al. Increased BDNF protein expression after ischemic or PKC epsilon preconditioning promotes electrophysiologic changes that lead to neuroprotection [J]. J Cereb Blood Flow Meta, 2015,35(1):121-130.

[12] Song C, Xi H, Yang L, et al. Propofol inhibited the delayed rectifier potassium current (I-k) via activation of protein kinase C epsilon in rat parietal cortical neurons[J]. Eur J Pharmacol, 2011,653(1-3): 16-20.

湖北省自然科學基金資助項目(2013CFB086)；中央高?；究蒲袠I務專項資金資助項目(2016YXZDO24)。

胡霽(E-mail: hbwhly01@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.012

R744

A

1002-266X(2016)43-0041-03

2016-05-26)