局部植入神經干細胞/膠原支架復合體對大鼠脊髓損傷的修復作用觀察

孫慶治，周成福，李瑩

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154003)

局部植入神經干細胞/膠原支架復合體對大鼠脊髓損傷的修復作用觀察

孫慶治，周成福，李瑩

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154003)

目的 觀察局部植入神經干細胞/膠原支架復合體對大鼠脊髓損傷的修復作用。方法 分離、培養、鑒定SD大鼠神經干細胞，將其植入膠原支架中，制備神經干細胞/膠原支架復合體。取90只6周齡SD大鼠，隨機分為A、B、C組，各30只，均常規行左側脊髓半切術，制備T10脊髓半橫斷損傷模型;A組脊髓切除后于缺損區植入神經干細胞/膠原支架復合體，B組脊髓切除后于缺損區植入膠原支架，C組脊髓切除后不作特殊處理。術后1～8周，每周分別對三組大鼠進行BBB評分(評價其左后肢運動功能)；術后第4、8周時，三組各處死大鼠15只，進行脊髓組織結構及病理形態觀察。結果 ①術后第4～8周時，A組大鼠的左下肢BBB評分明顯高于B、C組(P均<0.05)。②術后第4周時，A組大鼠脊髓內支架與周圍組織連接緊密，有少量空洞形成；B組大鼠脊髓內支架與周圍神經組織形成纖維蛋白連接，并有較多空洞形成；C組大鼠脊髓缺損較大，缺損區周邊有較多神經元及神經膠質細胞死亡。術后第8周時，A組大鼠脊髓內有較多的神經纖維生成，支架與周圍神經組織形成一體，連接緊密，無空洞形成；B組大鼠脊髓內衣支架與周圍神經組織連接較緊密，有一定量的空洞形成；C組大鼠脊髓缺損區有島狀神經組織形成，細胞排列不整，仍有大面積缺損區存在。③術后第4周時，A組大鼠脊髓缺損區的神經纖維排列較規律，B組與C組脊髓缺損區排列雜亂。術后第8周時，A組脊髓缺損區神經纖維排列有序，彼此間連接緊密；B組與C組脊髓缺損區神經纖維，但仍雜亂，纖維之間不能形成突觸連接。結論 局部植入神經干細胞/膠原支架復合體可以較好修復損傷的大鼠脊髓，并促進大鼠肢體運動功能的恢復。

脊髓損傷；神經干細胞；膠原支架；神經干細胞/膠原支架復合體；BBB評分

脊髓損傷患者會出現損傷平面以下的肢體感覺、運動喪失及大小便障礙[1]。目前，脊髓損傷的治療主要是通過手術對脊髓進行減壓及內固定，但療效并不理想。近年來，有關干細胞移植治療脊髓損傷的研究較多，但效果不一。膠原蛋白可以引導神經再生，具有免疫原性低、組織相容性好的特點[2,3]。2015年10月8日～2016年3月1日，我們將SD大鼠的神經干細胞植入膠原支架中，制備神經干細胞/膠原支架復合體，將其用于大鼠脊髓損傷的修復，并進行了觀察。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料、主要試劑及儀器 SPF級6周齡SD大鼠共120只，體質優良，平均體質量270 g，雌雄不限。膠原支架由佳木斯大學材料工程學院王晶教授課題組惠贈(新鮮牛筋膜剔除脂肪及肌肉成分后通過化學方法去除可溶性蛋白，干燥后就是有序的可用膠原蛋白，將其制備成2 mm3塊狀，即膠原支架)。DMEM/F12培養基，表皮生長因子(EGF)，無血清培養添加劑B27，堿性成纖維生長因子(bFGF)，多聚賴氨酸，巢蛋白(Nestin)溶液，核因子抗體。TC2323二氧化碳培養箱。

1.2 神經干細胞/膠原支架復合體的制備 取6周齡SPF級SD大鼠30只，雌雄配對后隔離飼養，待乳鼠出生后24 h內分離其海馬組織，切成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，吸管反復吹打，使其呈懸液狀，200目濾網過濾懸液，制成均勻一致的細胞懸液，臺盼藍染色細胞懸液并觀察細胞存活情況。調整細胞密度為5×105/mL，接種于培養瓶中，加入20 ng/mL 的bFGF、20 ng/mL 的EGF和含2% B27的DMEM/F12培養液。將培養瓶放入 培養箱(37 ℃、5% CO2、80%濕度)培養，3 d換液(半量換液)1次。細胞原代培養7 d后，高速離心細胞懸液得到神經干細胞球，用吸管輕輕吹打細胞球后將其移入高速離心管內離心，去除上清液后用小尖頭吸管繼續吹打，將神經干細胞球制成單細胞懸液，臺盼藍染色，計算細胞存活率，細胞分瓶繼續傳代，7～10 d傳代1次。取第4代神經干細胞球，制成單細胞懸液，種植在培養基上附片、固定，加入條件培養基24 h后，進行免疫組化染色鑒定,細胞表達Nestin作為神經干細胞的標志。將提前備好的膠原支架進行消毒，在無菌環境下將神經干細胞種植于膠原支架上。

1.3 SD大鼠脊髓損傷模型制作及神經干細胞/膠原支架復合體植入 90只SD大鼠隨機分為A、B、C組，各30只。三組均常規行左側脊髓半切術，切除脊髓2 mm×3 mm×4 mm。A組脊髓切除后于缺損區植入神經干細胞/膠原支架復合體，B組脊髓切除后于缺損區植入膠原支架，C組脊髓切除后不作特殊處理；三組常規縫合手術切口。術后輔助大鼠大小便，同時防止大鼠自食。

1.4 神經干細胞/膠原支架復合體對SD大鼠脊髓損傷修復作用的觀察 術后每周1次(每次觀察5 min)對三組大鼠進行BBB評分[8](評價其左后肢運動功能)，共8次。術后4周、8周時每組各處死大鼠15只，切取其T6～T12節段脊髓，固定24 h，制成薄切片，HE染色，鏡下觀察脊髓組織結構。采用免疫組化SP法對大鼠脊髓切片進行染色，觀察脊髓病理改變。

2 結果

2.1 術后三組大鼠左下肢BBB評分比較 術后第1～8周三組大鼠左下肢BBB評分比較見表1。

2.2 術后三組大鼠脊髓組織結構及病理改變 ①術后第4、8周時三組大鼠脊髓組織結構(見圖1)：術后第4周時，A組大鼠脊髓內支架與周圍組織連接緊密，有少量空洞形成；B組大鼠脊髓內支架與周圍神經組織形成纖維蛋白連接，并有較多空洞形成；C組大鼠脊髓缺損較大，缺損區周邊有較多神經元及神經膠質細胞死亡。術后第8周時，A組大鼠脊髓內有較多的神經纖維生成，支架與周圍神經組織形成一體，連接緊密，無空洞形成；B組大鼠脊髓內衣支架與周圍神經組織連接較緊密，有一定量的空洞形成；C組大鼠脊髓缺損區有島狀神經組織形成，細胞排列不整齊，仍有大面積缺損區存在。②術后第4、8周時三組大鼠脊髓病理改變(見圖2)：術后第4周時，A組大鼠脊髓缺損區的神經纖維排列較規律，B組與C組脊髓缺損區神經纖維排列雜亂。術后第8周時，A組脊髓缺損區神經纖維排列有序，彼此間連接緊密；B組與C組脊髓缺損區神經纖維仍雜亂，纖維之間不能形成突觸連接。

表1 術后第1～8周三組大鼠左下肢BBB評分比較(分，

注：與C組相比，*P<0.05；與B組相比，P<0.05。

3 討論

近年來，多數醫學研究人員提出通過材料學、分子生物學途徑來修復損傷的脊髓，但相關研究都沒有取得突破。本實驗利用神經干細胞與組織工程材料有機結合形成的復合植入材料，誘導神經干細胞修復受損的脊髓神經，期望能為脊髓損傷的臨床治療提供新的研究方向。

注：a、b、c分別為術后第4周時A、B、C組大鼠脊髓組織結構，d、e、f分別為術后第8周時A、B、C組大鼠脊髓組織結構。

圖1 術后第4、8周時三組大鼠脊髓組織結構(HE染色，200×)

注：a、b、c分別為術后第4周時A、B、C組大鼠脊髓病理形態；d、e、f別為術后第8周時A、B、C組大鼠脊髓病理形態。

圖2 術后第4、8周時三組大鼠脊髓病理形態(免疫組化染色，200×)

脊髓損傷的動物實驗研究大多以SD大鼠作為實驗對象[4]。造成脊髓損傷的實驗方法較多，如Allen重物打擊法及改良方法、脊髓壓迫法、脊髓牽拉法、脊髓切割法等。無論選擇哪種方法，其目的就是要創造一個理想化、更接近臨床的脊髓損傷模型。理想的模型要具有操控性、重復性、穩定性等特點[5～7]。脊髓切割法更符合這一要求，所以在本研究中選擇此種方法制備脊髓損傷模型。在脊髓損傷模型制備中，以T10為中心，造成脊髓損傷，原因是大鼠胸段脊髓損傷椎板咬除便利，且可以避開排便神經，更便于術后護理[8]。要保證術后大鼠存活率，要求用同一方法制備脊髓損傷模型[9,10]，并做到以下幾點：①術后的大鼠分開飼養，避免擁擠及踩踏事件的發生；②手術操作過程中要細心、輕柔，造成的創傷不能太大，避免損傷硬脊膜；③因隨著脊髓損傷節段的增高，實驗動物的死亡率增高，故損傷的脊髓節段不要太高，一般選擇T9或T10節段[11,12]，本研究選擇的是T10節段；④造成脊髓損傷后，用抗生素反復沖洗傷口，持續肌注抗生素至術后第3天，通過觀察大鼠尿路感染情況及大鼠的狀態來決定是否停用抗生素；⑤術后給予大鼠皮下注射生理鹽水2 mL，保證大鼠水分充足；⑥術后每天給大鼠擠尿，5 min/次，2次/d，1周后恢復大鼠的自主排尿；⑦保持大鼠籠舍干爽，每2天換1次窩內墊料；⑧每天用白熾燈照射鼠舍2 h,保證大鼠舍內溫度適宜[13,14]。

在本研究中，BBB評分結果表明，在術后前4周三組大鼠左下肢運動功能恢復較快，第5～8周左下肢功能恢復較慢，其中A、B組比C組左后肢運動功能恢復快，A組大鼠左后肢運動功能恢復最好。組織學觀察可見，術后第4周時A組大鼠脊髓內支架與周圍組織連接緊密、有少量空洞形成，術后第8周時大鼠脊髓內有較多的神經纖維生成、支架與周圍神經組織形成一體且連接緊密、無空洞形成；術后第4周時B組大鼠脊髓內支架與周圍神經組織形成纖維蛋白連接、有較多空洞形成，術后第8周時大鼠脊髓內支架與周圍神經組織連接較緊密、有一定量的空洞形成；術后第4周時C組脊髓缺損較大、缺損周邊有較多神經元及膠質細胞死亡，術后第8周時脊髓缺損面積減少、缺損區有散在神經組織形成、細胞排列不整、仍有大面積缺損存在。無論術后第4周時還是第8周時，A組大鼠脊髓的恢復均優于B、C組，第8周時其支架與周圍神經組織形成一體，更能促進神經的恢復。病理觀察可見，A組脊髓損傷處有較多的新生神經纖維，能更好地與原有周圍神經組織形成連接，而B組與C組脊髓損傷處僅有較少的神經纖維生長，更能說明A組的處置方法可以為神經纖維的生成提供良好的生物環境。

綜上所述，局部植入神經干細胞/膠原支架復合體可以較好修復損傷的大鼠脊髓，并促進大鼠肢體運動功能的恢復。

[1] Satake K, Lou J, Lenke LG. Migration of mesenchymal stem cells through cerebrospinal fluid into injured spinal cord tissue[J]. Spine， 2004，19(18):1971-1979.

[2] Kuffler DP. Maximizing neuroprotection: where do we stand[J]. Ther Clin Risk Manag， 2012，8(3):185-194.

[3] McCall J, Weidner N, Blesch A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration[J]. Cell Tissue Res, 2012，349(1):27-37.

[4] 劉雷.脊髓損傷模型制備及評價的研究進展[J].華西醫藥，2005,20(3)：594-595.

[5] Kwon BK, Sekhon LH, Fehlings MG. Emerging repair, regeneration, and translational research advances for spinal cord injury[J]. Spine， 2010，35(21):263-270.

[6] Devivo MJ. Epidemiology of traumatic spinal cord injury: trends and future implications[J]. Spinal Cord， 2012，50 (5):365-372.

[7] Wright KT, El Masri W, Osman A, et al. Concise review: bone marrow for the treatment of spinal cord injury: mechanisms and clinical applications[J]. Stem Cell, 2011,29(2):169-178.

[8] Mafi P, Hindocha S, Mafi R, et al. Evaluation of biological protein-based collagen scaffolds in cartilage and musculoskeletal tissue engineering:a systematic review of the literature[J]. Curr Stem Cell Res Ther， 2012，7(4):302-309.

[9] Augello A, Tasso R, Negrini SM, et al. Bone marrow mesenchymal progenitor cells inhibit lymphocyte proliferation by activation of the programmed death 1 pathway[J]. Eur J Immunol， 2005，35(5):1482-1490.

[10] Glennie S, Soeiro I, Dyson PJ, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells[J]. Blood， 2005，105(7):2821-2827.

[11] Stang F, Fansa H, Wolf G, et al. Collagen nerve conduits-assessment of biocompatibility and axonal regeneration[J]. Biomed Mater Eng， 2005，15(1-2):3-12.

[12] Cen L, Liu W, Cui L, et al. Collagen tissue engineering: development of novel biomaterials and applications[J]. Pediatr Res，2008，63(5):492-496.

[13] Cao J, Sun C, Zhao H, et al. The use of laminin modified linear ordered collagen scaffolds loaded with laminin-binding ciliary neurotrophic factor for sciatic nerve regeneration in rats[J]. Biomaterials， 2011，32(16):3939-3948.

[14] Jackson WM, Nesti LJ, Tuan RS. Concise review: clinical translation of wound healing therapies based on mesenchymal stem cells[J]. Stem Cell Transl Med， 2012，1(1):44-50.

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12531717)。

李瑩(E-mail： sqz_sun@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.013

R744

A

1002-266X(2016)43-0044-03

2016-04-01)