5-氟尿嘧啶與腸外營養液配伍制劑的體外穩定性和體內抗腫瘤活性

劉廣宣，趙茜，隋月，關丁越，孫博，朱丹彤，齊先福

(遼寧省腫瘤醫院，沈陽110042)

5-氟尿嘧啶與腸外營養液配伍制劑的體外穩定性和體內抗腫瘤活性

劉廣宣，趙茜，隋月，關丁越，孫博，朱丹彤，齊先福

(遼寧省腫瘤醫院，沈陽110042)

目的 觀察5-氟尿嘧啶(5-Fu)與腸外營養液配伍制劑(簡稱5-Fu腸外營養液)的體外穩定性和體內抗腫瘤活性，為其臨床應用提供依據。方法 配制空白腸外營養液及5-Fu腸外營養液，室溫條件下觀察配制24 h內兩種營養液的外觀、脂肪乳微粒的平均粒徑及變異系數、pH值、滲透壓，采用高效液相色譜分析法分析5-Fu腸外營養液中5-Fu含量的穩定性。將小鼠肝癌細胞H22瘤株接種于小鼠，制備移植性實體瘤模型。接種第3天將小鼠隨機分為5-FU-TPN-L、5-FU-TPN-M、5-FU-TPN-H、5-FU-NS、TPN及對照組，每組10只。前三組分別腹腔注射含30、65、130 mg/kg 5-Fu的5-Fu腸外營養液，后三組分別腹腔注射含65 mg/kg 5-Fu的生理鹽水注射液及等量的空白腸外營養液、生理鹽水，均隔天給藥1次，共給藥5次。末次給藥結束第2天處死小鼠，計算抑瘤率。結果 5-Fu腸外營養液與空白腸外營養液配制24 h內外觀、脂肪乳微粒的平均粒徑及變異系數、pH值、滲透壓和含量均無明顯變化(P均>0.05)。5-FU-TPN-L、5-FU-TPN-M、5-FU-NS、TPN組抑瘤率分別為24.3%、91.8%、78.7%、14.6%，5-FU-TPN-M、5-FU-NS組抑瘤率均高于5-FU-TPN-L、TPN組，且5-FU-TPN-M組高于5-FU-NS組，組間比較P均<0.01；5-FU-TPN-H組藥物毒性較大，給藥過程中死亡6只，未統計抑瘤率。結論 5-Fu腸外營養液配制24 h內性質穩定，抗腫瘤活性較單獨給予5-Fu提高。

5-氟尿嘧啶；腸外營養液；配伍；抑瘤率；小鼠

研究顯示，約52%的惡性腫瘤患者伴有中度或重度營養不良[1]，90%以上的患者需要改善營養狀況。全胃腸外營養(TPN)是從靜脈內供給患者營養物質，是手術前后及危重患者營養支持的主要手段。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是消化系統腫瘤的首選化療藥物之一，通過將細胞周期阻滯于G1/S期、干擾細胞基本生物合成、誘導細胞凋亡等發揮抑制腫瘤生長的作用。癌癥患者尤其是晚期癌癥患者常需要同時通過靜脈輸液給予化療藥物及腸外營養液，但二者是否可以配伍及配伍后的抗腫瘤效果報道較少。2015年12月～2016年3月，我們觀察了5-Fu與腸外營養液配伍制劑(簡稱5-Fu腸外營養液)的體外穩定性和體內抗腫瘤活性，旨在為其臨床應用提供依據。1 材料與方法

1.1 材料 ①儀器：9110高效液相色譜儀，TGL-16G臺式高速離心機，CPA124S電子天平，PHS-25C精密酸度計，Nicomp 380粒度測定儀，L-119A試管恒溫加熱儀，L-128氮吹濃縮儀。②試劑：5-Fu復方氨基酸注射液(15-HBC)，脂肪乳注射液，N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺注射液，注射用水溶性維生素，注射用脂溶性維生素(Ⅱ)，注射用脂溶性維生素(Ⅱ)專用溶媒，多種微量元素注射液(Ⅱ)，硫酸鎂注射液，葡萄糖酸鈣注射液，葡糖糖注射液，復合磷酸氫鉀注射液，胰島素注射液。③動物：昆明種小鼠60只，體質量18～22 g，雌雄不限，由遼寧長生生物技術有限公司提供，動物許可證號為SCXK2015-0001。細胞株：小鼠肝癌H22細胞株為本實驗室保存。

1.2 5-Fu腸外營養液制備 先制備空白腸外營養液：將生理鹽水1 000 mL充入營養袋；將硫酸鎂注射液、氯化鉀注射液、N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺注射液、多種微量元素注射液(Ⅱ)、葡萄糖酸鈣注射液依次加入復方氨基酸注射液中混勻，一并充入營養袋；將50%葡萄糖注射液、胰島素注射液、復合磷酸氫鉀注射液依次加入10%葡萄糖注射液中，混勻，一并充入營養袋；取注射用水溶解1支注射用脂溶性維生素(Ⅱ)，再將此溶液打入注射用水溶性維生素(1支)的安瓿中，最后抽取全部混合藥液加入脂肪乳中，混勻，一并充入營養袋，再次混勻，即得空白營養液。按此法平行配制空白營養液6份。制備5-Fu腸外營養液：采用空白腸外營養液將規格為250 mg/10 mL的5-Fu注射液進行12.5倍稀釋，得到含20 mg/mL 5-Fu的腸外營養液。按此法平行配制6份。

1.3 5-Fu腸外營養液相關指標觀察

1.3.1 理化性質 室溫條件下觀察空白腸外營養液及5-Fu腸外營養液的外觀；分別于配制0、2、4、6、8、10、12、16、24 h時對兩種營養液采樣，采用Nicomp 380粒度檢測儀測定脂肪乳微粒的平均粒徑(MD)及粒徑變異系數(CV)，采用pH計測定pH值，采用滲透壓測定儀測量滲透壓。

1.3.2 5-Fu含量的穩定性及回收率 采用高效液相色譜分析法。色譜柱：Venusil ASB C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：水(磷酸調節pH為3.0)-甲醇(95∶5)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：265 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。取5-Fu腸外營養液6份，分別進樣并記錄色譜圖，計算5-Fu含量及相對標準偏差(RSD)；取5-Fu腸外營養液3份，分別精密加入120.00 μg/mL甲硝唑對照液1.8、2.2、2.6 mL，分別進樣并記錄色譜圖，計算樣品平均回收率。1.3.3 抗腫瘤作用 液氮中取出保種的小鼠肝癌H22細胞凍存管，迅速置于37 ℃溫水中復蘇。將復蘇的H22細胞懸液接種于小鼠腹腔內，接種7天后無菌條件下抽取乳白色黏稠腹水，倒置顯微鏡下計數，腫瘤細胞活度>95%時調整瘤細胞密度為2.0×107個/mL。將腫瘤細胞混懸液接種于60只昆明種小鼠右前腋下皮下組織(0.2 mL/只)，建立腫瘤模型。于接種第3天將小鼠隨機分為5-FU-TPN-L、5-FU-TPN-M、5-FU-TPN-H、5-FU-NS、TPN及對照組，每組10只，前三組分別腹腔注射含30、65、130 mg/kg 5-Fu的5-Fu腸外營養液，后三組分別腹腔注射含65 mg/kg 5-Fu的生理鹽水注射液及等量的空白腸外營養液、生理鹽水，均隔天給藥1次，共給藥5次。末次給藥結束第2天處死小鼠，完整剝離皮下瘤結節，稱取質量，計算抑瘤率。抑瘤率(%)=(對照組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量)/對照組平均瘤質量×100%。

2 結果

2.1 5-Fu腸外營養液的理化性質 配制24h內，5-Fu腸外營養液及空白腸外營養液外觀均為乳白色液體，未見分層、渾濁和沉淀等變化。配制0、2、4、6、8、10、12、16、24h時兩種液體脂肪乳微粒的MD、CV及pH值、滲透壓均無明顯變化(P均>0.05)，且CV均<0.5，pH值均為5.0～6.6，滲透壓均<900mOsm/L。見表1。

表1 5-Fu腸外營養液及空白腸外營養液配制各時間點MD、CV、pH值及滲透壓

2.2 5-Fu腸外營養液中5-Fu的穩定性及回收率 6份5-Fu腸外營養液中5-Fu含量分別為99.33%、100.80%、100.25%、100.34%、99.67%、98.91%，RSD為0.71%(<2%)，說明樣品制備方法重復性好。3份5-Fu腸外營養液平均回收率分別為102.68%、99.45%、101.12%，回收率較好。

2.3 5-Fu腸外營養液的抗腫瘤作用 5-FU-TPN-L、5-FU-TPN-M、5-FU-NS、TPN組抑瘤率分別為24.3%、91.8%、78.7%、14.6%，5-FU-TPN-M、5-FU-NS組抑瘤率均高于5-FU-TPN-L、TPN組，且5-FU-TPN-M組高于5-FU-NS組，組間比較P均<0.01；5-FU-TPN-H組毒性較大，給藥過程中死亡6只，未統計抑瘤率。見表2。

表2 各組腫瘤質量及抑瘤率

3 討論

TPN是指由胃腸外途徑(通常是靜脈)供給機體足夠的蛋白質(氨基酸)、脂肪、糖類、維生素、微量元素、電解質和水分等，因其所含組分較多，通常單獨輸注，理論上不宜與其他藥物混合使用，但為方便臨床和減少對患者的損傷，已有西咪替丁、法莫替丁和甲硝唑等藥物與腸外營養液配伍的報道[2～6]。本研究結果顯示，5-Fu腸外營養液配制24 h內其外觀、脂肪乳粒徑大小及分布、pH值、滲透壓、含量均無顯著性變化，與空白腸外營養液5-Fu腸外營養液各時間點上述指標差異均無統計學意義，提示5-Fu腸外營養液性質較穩定，5-Fu未對腸外營養液理化性質造成明顯影響。

本研究選取小鼠肝癌H22細胞進行抑瘤效果觀察，因H22細胞便于小鼠接種，易于造模，且H22對5-Fu相對敏感。結果顯示， 5-FU-TPN-M、5-FU-NS組抑瘤率均高于5-FU-TPN-L、TPN組，且5-FU-TPN-M組高于5-FU-NS組，含65 mg/kg 5-Fu的5-Fu腸外營養液抑瘤率高于5-Fu單獨給藥組。上述結果產生原因可能為：①5-Fu主要針對增殖期腫瘤細胞，難以對休止期(G0期)腫瘤細胞產生殺傷作用，而化療過程中大部分腫瘤細胞處于G0期(G0期細胞對潛在的致死損傷有較強的修復能力，往往是腫瘤復發和轉移的根源)。有研究認為，營養支持能刺激腫瘤細胞的增殖和發展，促進G0期腫瘤細胞進入增殖期，從而提高化療敏感性，達到提高化療療效的目的[7]。Wang等[8]建立了裸鼠食管癌模型，發現胰島素與化療藥聯用能達到增效、不增加毒性的目的。腸外營養液中所含胰島素可能是5-Fu抗腫瘤活性增加的原因。②另有觀點認為，腸外營養液通過提高機體免疫功能，誘導腫瘤細胞凋亡[9]。腸外營養液中含有的精氨酸組分具有組織特異性免疫刺激作用，藥理劑量的精氨酸可明顯改善機體的免疫功能，其作用機制主要為增加T淋巴細胞對刀豆素A(ConA)和植物血球凝集素(PHA)的反應性，增加CD4+細胞數量；提高外周血NK細胞數量、NK細胞活性及LAK細胞活性，促進IL-2產生，增加細胞毒性T細胞的功能，誘導IL-2R表達[10]。此外，谷氨酰胺亦是腸外營養液中的常見成分，在各種組織中其均為重要的氮源和能量來源，可直接供能于淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞，通過促進淋巴細胞增殖、細胞因子產生及吞噬細胞等的殺傷作用而發揮免疫調節功能。谷氨酰胺能促進谷胱甘肽的合成，通過維持抗氧化系統功能而參與對機體的免疫保護[11,12]。③腸外營養液中含有鉻、銅、鐵、錳、鉬、硒、鋅等多種微量元素，其中鋅可通過激活p53及caspase通路促進腫瘤細胞凋亡[13]；硒可調控腫瘤細胞信號轉導途徑，修飾p53的氨基酸殘基位點；通過影響信號轉導途徑中的連接蛋白如絲裂原蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)，促進腫瘤細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用[14～16]。此外，藥理學研究表明，金屬離子與具有生物活性的有機配體結合后，通過配體與金屬離子之間的協同作用使藥效得到增強。5-Fu可能與銅、鐵、鋅等金屬離子形成配合物，生成Cu(5-Fu)2Cl2、Cu(5-Fu)2(NO3)2、Zn(5-Fu)2Cl2和Fe(5-Fu)3SO4等配合物，進而增強其療效[17,18]。

綜上所述，5-Fu腸外營養液配伍24 h內性質穩定，且抗腫瘤活性增強，但具體作用機制有待進一步探討。

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Stability in vitro and antitumor activity in vivo of preparations of 5-Fu mixed with parenteral nutrition solution

LIUGuangxuan,ZHAOQian,SUIYue,GUANDingyue,SUNBo,ZHUDantong,QIXianfu

(LiaoningCancerHospital,Shenyang110042,China)

Objective To observe the compatible stability in vitro and antitumor activity in vivo of preparations of 5-fluorouracil (5-Fu) mixed with total parenteral nutrition (TPN) solution (5-Fu and TPN solution) and to provide the basis for its clinical application. Methods The blank parenteral nutrition solution and 5-Fu and TPN solution were mixed at room temperature for 24 h. The appearances were observed and the mean diameter (MD) and coefficient of variation (CV) of fat particles, pH value and osmotic pressure was evaluated. The stability of 5-Fu in the 5-Fu and TPN solution was determined by HPLC. The H22 transplanted models of mice were established. Sixty mice were divided into six groups: 5-FU-TPN-L (30 mg/kg), 5-FU-TPN-M (65 mg/kg), 5-FU-TPN-H (130 mg/kg), 5-FU-NS (65 mg/kg), TPN and the control group, each group had 10 mice. On the day 3 after being inoculated with H22 tumor cells, the mice in the six groups were intraperitoneally injected with the above six kinds of liquids, separately, once every other day for 5 times. On day 2 after the last administration, mice were killed and antitumor rate was calculated. Results Compared with the blank parenteral nutrition solution, there were no significant changes in the appearances, MD, CV, pH value, osmotic pressure and the contents of 5-Fu within 24 h of 5-Fu and TPN solution (allP>0.05). The antitumor rates of the 5-FU-TPN-L, 5-FU-TPN-M, 5-FU-NS, and TPN groups were 24.3%, 91.8%, 78.7% and 14.6%, the antitumor rate of the 5-FU-TPN-M and 5-FU-NS groups were higher than those of the 5-FU-TPN-L and TPN groups, and the antitumor rate of 5-FU-TPN-M group was higher than that of the 5-FU-NS group, significant difference was found between every two groups (allP<0.01). The toxicity of 5-FU-TPN-H was strong, and 6 mice died, so no statistics were carried out. Conclusion 5-Fu in TPN solution is stable within 24 h and the antitumor effect of 5-Fu at 65 mg/mL is better than single administration of 5-Fu.

5-fluorouracil; parenteral nutrition solutions; compatibility; antitumor rate; mice

遼寧省自然科學基金資助項目(2103020186)。

劉廣宣(1963-)，男，主任藥師，研究方向為腫瘤藥理學。E-mail: guangxuan2004@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.003

R979.1

A

1002-266X(2016)44-0008-04

2016-03-12)