六月青多糖對S180肉瘤細胞增殖的影響及機制

湯小軍，黃仁彬，盧庭婷，黃建春

(1廣西衛生職業技術學院，南寧530021；2 廣西醫科大學)

六月青多糖對S180肉瘤細胞增殖的影響及機制

湯小軍1，黃仁彬2，盧庭婷1，黃建春2

(1廣西衛生職業技術學院，南寧530021；2 廣西醫科大學)

目的 探討六月青多糖對S180肉瘤細胞增殖的影響及其作用機制。方法 取SPF級昆明種小鼠48只，腹腔注射S180肉瘤細胞株，注射第8天時抽取腹水，分離細胞接種到96孔培養板；隨機分為對照組、六月青多糖組。六月青多糖組加入適量六月青多糖，使其終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125 g/L；對照組加入等量生理鹽水。分別于培養24、48、72 h時采用MTT法檢測各孔光密度(OD)值，計算細胞增殖抑制率。另取小鼠36只腹腔注射S180肉瘤細胞株，7 天后抽取腹水，分離癌細胞，將癌細胞懸液分別接種于小鼠右側腋窩皮下，接種第11天時處死荷瘤小鼠，抽取腹腔積液并取脾臟，分離培養腹腔巨噬細胞及脾淋巴細胞，隨機分為兩組。六月青多糖組分別加入終濃度為200、100、50 μg/mL的六月青多糖；對照組加入等量生理鹽水；培養24 h時采用ELISA試劑盒檢測腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-6水平及脾淋巴細胞IL-2、IFN-γ水平。結果 同時間點六月青多糖組細胞增殖抑制率隨濃度增加而升高(P均<0.05)，同濃度下六月青多糖組細胞增殖抑制率隨作用時間延長而升高(P均<0.05)。與對照組比較，200、100、50 μg/mL六月青多糖組腹腔巨噬細胞TNF-α水平逐漸降低(P<0.05或<0.01)；與對照組比較，100、200 μg/mL六月青多糖組腹腔巨噬細胞IL-6水平均增加，脾淋巴細胞IL-2、IFN-γ水平均增加(P<0.05或<0.01)。結論 六月青多糖體外對S180細胞增殖具有抑制作用，其機制可能為促進腹腔巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6和脾淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ。

肉瘤；六月青多糖；腹腔巨噬細胞；脾淋巴細胞；炎癥因子

廣西民間草藥六月青是爵床科植物肖雞籠(頂頭馬蘭)的地上干燥部分，六月青多糖是其主要成分。體內研究發現，六月青多糖能抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長，增強免疫功能、抑制炎癥反應、促進細胞凋亡可能是其作用機制[1,2]。但六月青多糖在體外對S180肉瘤細胞的作用及其機制未見報道。2014年6月～2015年8月，本研究觀察了六月青多糖在體外對S180肉瘤細胞增殖的影響，現分析結果，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠肉瘤細胞株S180購自廣西中醫藥研究院。SPF級昆明種小鼠120只，體質量(20.0±2.0)g，購自廣西醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證：SCXK(桂)2009-0002，實驗動物使用許可證：SYXK(桂)2009-0004。六月青多糖由廣西醫科大學藥學院提供，純度為99%；RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司；小鼠TNF-α、IL-6、IL-2和IFN-γ ELISA試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 六月青多糖干預及細胞增殖抑制率檢測 取小鼠48只，均腹腔注射S180肉瘤細胞株，注射第8天時抽取腹水，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS液和RPMI 1640培養液各洗兩次。調整細胞密度為1×108個/L，接種到96孔培養板，180 μL/孔。隨機分為兩組，六月青多糖組分別加入適量六月青多糖，使其終濃度為4、2、1、0.5、0.25、0.125 g/L(20 μL/孔)；對照組加入等量生理鹽水。各組均置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，分別于培養24、48、72 h時每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，繼續培養4 h，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，分別加入200 μL DMSO，振蕩10 min，檢測492 nm處各孔光密度(OD)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)[3]=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2 六月青多糖干預及腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-6檢測 取小鼠36只，腹腔注射S180肉瘤細胞株，7 天后抽取腹水，用生理鹽水調整細胞密度為1×1010個/L，將癌細胞懸液分別接種于另外36只小鼠右側腋窩皮下，0.2 mL/只。接種第11天時處死，向其腹腔注入4 ℃的RPMI 1640培養液5 mL，揉腹部1 min后抽取腹腔積液，1 500 r/min離心5 min；RPMI 1640培養液調整細胞密度為1×1010個/L，接種至96孔培養板，100 μL/孔；37 ℃、5% CO2培養箱中孵育2 h，棄上清液，PBS洗3次，棄非黏附細胞；在貼壁的細胞中加入RPMI 1640培養液100 μL/孔，經倒置相差顯微鏡觀察和HE染色觀察貼壁細胞為巨噬細胞[4]。隨機分為兩組，六月青多糖組分別加入適量六月青多糖，使其終濃度為200、100、50 μg/mL；對照組加入等量生理鹽水。兩組均置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，培養24 h時于4 ℃條件下1 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用ELISA試劑盒檢測腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-6水平，步驟均參照試劑盒說明書。

1.2.3 六月青多糖干預及脾淋巴細胞IL-2、IFN-γ檢測 取1.2.2中處死的S180荷瘤小鼠，無菌條件下取脾臟，用D-Hank′s液洗后剪碎，過200目篩，1 500 r/min離心10 min，沉淀液中加入2 mL D-Hank′s液，用小鼠淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，用RPMI 1640培養液調整細胞密度為5×106個/mL[5]，臺盼藍檢測細胞活力>95%。隨機分組，分組方法及處理同1.2.2，各組均置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，培養24 h時于4 ℃條件下1 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用ELISA試劑盒檢測脾淋巴細胞IL-2、IFN-γ水平，步驟均參照試劑盒說明書。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 同時間點六月青多糖組細胞增殖抑制率隨濃度增加而升高(P均<0.05)，同濃度下六月青多糖組細胞增殖抑制率隨作用時間延長而升高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率

2.2 各組腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-6水平和脾淋巴細胞IL-2、IFN-γ水平比較 與對照組比較，六月青多糖組各劑量作用后腹腔巨噬細胞TNF-α水平均升高(P<0.05或<0.01)。與50 μg/mL六月青多糖組比較，100、200 μg/mL六月青多糖組腹腔巨噬細胞TNF-α水平均升高(P均<0.05)，200 μg/mL六月青多糖組腹腔巨噬細胞IL-6水平升高、脾淋巴細胞IFN-γ水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-6水平和脾淋巴細胞IL-2、IFN-γ水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與50 μg/mL六月青多糖組比較，△P<0.05。

3 討論

目前腫瘤治療主要采用化療、放療、手術和生物治療等綜合措施，臨床應用最廣泛的抗腫瘤西藥有金屬鉑類、抗代謝類、烷化劑等，但均具有干擾免疫系統、血液系統、消化系統等毒副作用。與抗腫瘤西藥相比，中草藥抗腫瘤治療具有多層次、多通路、多目標、多成分的特點，我國已對藥用植物中28個科(屬)3 000多種藥用植物進行了抗腫瘤作用篩選，發現200多種植物中含有抗腫瘤活性成分，主要包括蛋白質類、多糖類、蟾蜍甾二烯類、萜類、黃酮類、生物堿類、苷類等[6～9]。中藥中的多糖成分是目前抗腫瘤藥物研究的熱點，其抗腫瘤作用顯著且毒副作用小。多糖成分抗腫瘤的主要機制為：①中藥多糖通過激活T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞等細胞信號通路，促進細胞因子和抗體生成，發揮免疫調節作用[10]；②通過影響腫瘤細胞的生長、分裂、增殖等多個環節實現對腫瘤生長的抑制。目前，靈芝、人參、香菇、銀耳、蘆薈等中藥(主要成分均為多糖)作為抗腫瘤藥物或輔助藥物已經廣泛應用于臨床[11,12]。

《本草拾遺》記載，六月青能涼血、活血、疏肝利濕、消腫止痛，主要用于急慢性肝炎、黃疸、高血壓等治療。前期研究發現，六月青的主要活性成分是六月青多糖和皂苷，兩種成分均能抑制乙肝病毒的復制、保護肝細胞，對四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化均有預防和治療作用。此外，六月青石油醚部位和60%乙醇部位均能抑制胃癌細胞SGC7901、MGC803和乳腺癌細胞MDA-MB-231、口腔表皮樣癌細胞KB的生長，對小鼠免疫功能有明顯的增強作用[13]；六月青多糖可通過增強機體免疫功能、調節腫瘤細胞Bax和Bcl-2基因表達，進而抑制小鼠S180腫瘤生長[1,2]。本研究進一步發現，0.125、0.25、0.5、1、2、4 g/L六月青多糖作用24、48、72 h均可抑制S180細胞增殖，且具有濃度和時間依賴性。

腫瘤發生的原因之一是患者免疫系統功能低下導致免疫監視無能，腫瘤患者的免疫功能由早期的活躍狀態演變為中后期的抑制狀態，免疫狀態與病情呈負相關，因此腫瘤的治療措施之一是調節機體免疫功能[14]。機體免疫應答主要有細胞免疫應答和體液免疫應答，其中細胞免疫應答在抗腫瘤免疫中發揮關鍵作用，參與抗腫瘤細胞免疫的細胞主要有T淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞等，這些細胞被激活后通過分泌細胞因子發揮抗腫瘤作用，如激活的T淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子，增強細胞毒性T淋巴細胞的效應；活化的巨噬細胞釋放TNF-α、IL-6等細胞因子，激活B淋巴細胞產生抗體，促進T淋巴細胞、NK細胞的抗腫瘤效應[15～17]。本研究結果顯示，100、200 μg/mL六月青多糖均可促進S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6和脾淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ，提示六月青多糖可能通過刺激巨噬細胞、淋巴細胞產生一系列細胞因子從而發揮抗腫瘤作用。

綜上所述，六月青多糖可抑制體外S180肉瘤細胞增殖，刺激巨噬細胞、淋巴細胞產生TNF-α、IL-6、IL-2、IFN-γ可能是其作用機制，但其調節免疫細胞信號轉導通路的具體機制有待進一步探討。

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國家自然科學基金資助項目(81560587)；廣西教育廳高校科學研究項目(2013YB343)。

黃建春(E-mail: huangjianchun008@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.009

R730.52

A

1002-266X(2016)44-0030-03

2016-01-04)