PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路在乙醛刺激下大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6增殖中的作用

張迪，程敏，康馨丹，陳衛(wèi)剛，鄭勇

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832002；2 石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

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PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路在乙醛刺激下大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6增殖中的作用

張迪1，程敏1，康馨丹1，陳衛(wèi)剛2，鄭勇2

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832002；2 石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

目的 探討磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號傳導(dǎo)通路在乙醛刺激的大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6增殖中的作用。方法 將大鼠HSC-T6隨機(jī)分為6組：空白對照組(A組)：采用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；乙醛組(B組)：在A組基礎(chǔ)上加乙醛，使終濃度為200 μmol/L；實驗組在B組基礎(chǔ)上加入不同濃度(25、50、75、100 μmol/L)的PI3K/Akt通路抑制劑LY294002，分別稱為C、D、E、F組。用CCK-8法檢測大鼠HSC-T6增殖活力(用A值表示)。再隨機(jī)將HSC-T6分為3組：空白對照組(10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng))、乙醛組(在空白對照組基礎(chǔ)上加乙醛，使終濃度為200 μmol/L)、乙醛+LY294002組(在乙醛組的基礎(chǔ)上加入50 μmol/L LY294002)，用Western blotting法檢測大鼠HSC-T6中PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 A、B、C、D、E、F組A值分別為0.545 0±0.024 4、0.952 3±0.045 5、0.927 3±0.041 9、0.865 8±0.028 9、0.814 3±0.024 7、 0.759 3±0.220 0。與A組比較，其他各組A值均升高；與B、C組比較，D、E、F組降低(P均<0.01)。與空白對照組比較，乙醛組、乙醛+LY294002組PI3K、p-AKT蛋白相對表達(dá)量高(P均<0.01)，與乙醛組比較，乙醛+LY294002組降低(P<0.05)。結(jié)論 PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路部分參與調(diào)控乙醛刺激的大鼠HSC-T6增殖。

肝纖維化；肝星狀細(xì)胞；乙醛；磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號傳導(dǎo)通路；LY294002

肝硬化是臨床常見的一種慢性肝病，其病理基礎(chǔ)是肝纖維化[1]。酒精性肝纖維化是由于過量攝入乙醇導(dǎo)致肝臟發(fā)生肝纖維化及其引起的一系列病理變化。因此，酒精性肝損傷是造成肝纖維化的主要病因。乙醇本身不具有毒性，但其代謝產(chǎn)物乙醛卻可刺激肝星狀細(xì)胞(HSC)活化[2，3]。HSC是肝纖維化時過量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要來源, 激活的HSC大量增殖,發(fā)生表型改變并分泌過多的ECM沉積于肝臟，故目前認(rèn)為HSC的活化與增殖是肝纖維化進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)[4]。 已有研究證實，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號傳導(dǎo)通路是HSC活化與增殖導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的主要信號傳導(dǎo)通路[5]。但近年來PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路在乙醛刺激的HSC增殖中的作用報道較少。2016年3月1日～8月15日，我們進(jìn)行了相關(guān)探討。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞系：大鼠HSC-T6細(xì)胞株(廣州吉妮歐生物科技有限公司)。藥品與試劑：胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司 )；LY294002(美國Sigma公司)；CCK-8(東仁化學(xué)科技有限公司)；兔抗PI3K p110α單隆抗體、p-Akt(Ser473)單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)；小鼠抗β-actin單克隆抗體、山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記二抗、山羊抗小鼠IgG/辣根酶標(biāo)記二抗(北京中杉金橋有限公司)；化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理 大鼠HSC-T6以2×105/mL接種于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞6～8 h貼壁生長，24～48 h換液1次，待細(xì)胞增殖達(dá)到90%融合度時，用0.25%胰酶消化，將對數(shù)生長期的細(xì)胞1∶2傳代接種。將大鼠HSC-T6隨機(jī)分為6組：空白對照組(A組)：采用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；乙醛組(B組)：在A組基礎(chǔ)上加乙醛，使終濃度為200 μmol/L；實驗組用不同濃度(25、50、75、100 μmol/L)的LY294002預(yù)處理1 h后再加入乙醛，分別稱為C、D、E、F組。

1.3 大鼠HSC-T6增殖活力的檢測 采用CCK-8法。將大鼠HSC-T6用胰酶消化成懸浮狀態(tài)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至4×105/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞懸液100 μL，每組4個復(fù)孔，細(xì)胞生長至80%以上融合度時，用含0.4%胎牛血清的DMEM同步化處理24 h。實驗組用不同濃度的LY294002預(yù)處理1 h后，加入200 μmol/L(終濃度)的乙醛100 μL，放置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h(乙醛每12 h補(bǔ)充一次)，棄去舊的培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8 10 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)75 min后用酶標(biāo)儀，單波長測定每孔吸光度(A)值，測定波長為460 nm。

1.4 HSC-T6中PI3K、p-AKT蛋白相對表達(dá)的檢測 采用Western blotting法。將HSC-T6隨機(jī)分成空白對照組(10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng))、乙醛組(在空白對照組基礎(chǔ)上加200 μmol/L乙醛3 mL)、乙醛+LY294002組(加入50 μmol/L的LY294002作用1 h后，再加入200 μmol/L乙醛3 mL)，加入細(xì)胞裂解液，提取蛋白，統(tǒng)一蛋白濃度為40 g/L，蛋白變性后待用。加樣量每孔7 μL，總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h，檢測PI3K時加入兔抗鼠一抗(1∶2 000), 檢測p-Akt時加入兔抗一抗(1∶1 000)，加入β-actin鼠抗鼠一抗(1∶1 000)，4 ℃冰箱過夜, 1×TBST洗5次, 5 min/次, 再各加入山羊抗兔二抗(1∶20 000), β-actin加入山羊抗鼠二抗(1∶20 000)，常溫下孵育2 h, 再用1×TBST洗5次, 5 min/次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色,暗室曝光到X線片上,顯影、定影后將膠片置于凝膠成像進(jìn)行定量分析, 計算目的蛋白灰度值與β-actin蛋白灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 6組HSC-T6增殖活力比較A、B、C、D、E、F組A值分別為0.545 0±0.024 4、0.952 3±0.045 5、0.927 3±0.041 9、0.865 8±0.028 9、0.814 3±0.024 7、 0.759 3±0.220 0。與A組比較，其他各組A值均升高(P均<0.01)；與B、C組比較，D、E、F組降低(P均<0.01)。

2.2 3組HSC-T6內(nèi)PI3K、p-AKT蛋白相對表達(dá)量比較 見表1。

表1 3組HSC-T6內(nèi)PI3K、 p-Akt蛋白相對表達(dá)量比較

注：與空白對照組比較,#P<0.01；與乙醛組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

肝纖維化是肝臟慢性損傷后ECM可逆性沉積的創(chuàng)傷愈合過程，HSC是過量ECM的主要來源[6]。在各種因素作用下，HSC自身可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子與活化產(chǎn)物，這些因子可以通過各種信號通路調(diào)節(jié)HSC 的功能，PI3K/Akt 是其中重要的一條信號通路[7]。LY294002作為PI3K/Akt信號通路的特異性阻斷劑，可抑制HSC增殖，并誘導(dǎo)HSC凋亡發(fā)生，從而抑制肝纖維化的發(fā)展[8，9]。

本研究中，用200 μmol/L的乙醛預(yù)處理大鼠HSC-T6模擬體外酒精性肝纖維化實驗?zāi)Ｐ秃螅謩e加入不同濃度的LY294002，實驗結(jié)果顯示乙醛預(yù)處理的HSC-T6增殖均受到抑制，且隨著LY294002濃度的增大，抑制作用逐漸增強(qiáng)，說明阻斷PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路能有效抑制乙醛誘導(dǎo)的大鼠HSC-T6增殖，促進(jìn)大鼠HSC-T6凋亡，減少ECM分泌，從而起到延緩酒精性肝纖維化進(jìn)程的作用，同時為酒精性肝纖維化的治療提供了新的思路。

由于各個濃度的LY294002對大鼠HSC-T6均有毒性作用，高濃度LY294002可影響大鼠HSC-T6的形態(tài)，而低濃度的LY294002對HSC增殖的抑制作用又不明顯，因此，我們選用50 μmol/L的LY294002用于Western blotting試驗，檢測大鼠HSC-T6中PI3K/Akt信號通路上游蛋白PI3K、p-Akt的表達(dá)情況。實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，乙醛組PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)增加，說明在乙醛刺激大鼠HSC-T6增殖的過程中，可能影響了PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路，增強(qiáng)了PI3K蛋白的表達(dá)，繼而使Akt磷酸化增加，p-Akt蛋白表達(dá)增強(qiáng)。同時，與乙醛組比較，乙醛+LY294002組PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)降低，提示當(dāng)向體外酒精性肝纖維化模型中加入PI3K/Akt信號通路抑制劑阻斷該通路后，該通路上的兩個上游蛋白表達(dá)均受到抑制，這說明PI3K/Akt信號通路可能與酒精性肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)。

但值得注意的是，本實驗雖然使用了PI3K/Akt信號通路的特異性抑制劑，但是仍不能完全抑制乙醛對HSC-T6增殖的刺激作用，同時也不能完全降低PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)量，本研究分析產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能有以下兩點：①PI3K/Akt信號通路并非是調(diào)控乙醛刺激的HSC-T6增殖活性的惟一通路。眾所周知，細(xì)胞外刺激引起細(xì)胞反應(yīng)是通過細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑來實現(xiàn)的，不同的信號傳導(dǎo)途徑引起不同的生物學(xué)效應(yīng)，這些信號通路之間存在著交互作用而非獨立，眾多細(xì)胞信號通路網(wǎng)絡(luò)交互影響, 共同介導(dǎo)肝纖維化復(fù)雜的病理生理變化。也就說，即使阻斷了PI3K/Akt信號通路，但仍有其他信號通路作用于大鼠HSC-T6，刺激大鼠HSC-T6的活化與增殖，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的形成。②實驗中所使用的最高濃度LY294002(100 μmol/L)并沒有達(dá)到完全阻斷PI3K/Akt信號通路的最終藥物濃度。故出現(xiàn)了實驗組中HSC的增殖能力強(qiáng)于空白對照組，PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)量高于空白對照組這一結(jié)果。后期可以通過增大LY294002的濃度，看是否可以找到一個臨界濃度能夠完全抑制乙醛預(yù)處理的大鼠HSC-T6的增殖，來進(jìn)一步探討PI3K/Akt信號通路與乙醛刺激的大鼠HSC-T6增殖、凋亡之間可能存在的關(guān)系。

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Effects of PI3K/Akt signaling pathway on acetaldehyde-stimulated proliferation of hepatic stellate cells HSC-T6

ZHANGDi1,CHENMin,KANGXindan,CHENWeigang,ZHENGYong

(1GraduateSchoolofMedicine,ShiheziUniversity,Shihezi832002,China)

Objective To investigate the effects of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt signaling pathway specific inhibitor LY294002 on the proliferation of rat hepatic stellate cells (HSC-T6) stimulated by acetaldehyde. Methods The rat HSC-T6 cells were randomly divided into six groups: the blank control group (group A): we used DMEM culture solution with 10% fetal bovine serum (FBS) to culture, the acetaldehyde group (group B): we added acetaldehyde on the basis of the blank control group and made the final concentration be 200 μmol/L, the experimental group was added with different concentrations of PI3K/Akt pathway specific inhibitor LY294002 (25, 50, 75 and 100 μmol/L) on the basis of acetaldehyde group (group B), and then they were named groups C, D, E and F, respectively. CCK-8 was applied to detect the proliferation activity of rat HSC-T6 cells. And then HSC-T6 cells were randomly divided into three groups: the blank control group (added with DMEM culture solution with 10% fetal bovine serum), acetaldehyde group (added with acetaldehyde on the basis of blank control group and made the final concentration be 200 μmol/L), and acetaldehyde+LY294002 group (added with 50 μmol/L PI3K/Akt pathway specific inhibitor LY294002 on the basis of acetaldehyde group). Western blotting was used to detect the expression of PI3K and p-Akt protein in rat HSC-T6. Results The A values of groups A, B, C, D, E, and F were 0.545 0±0.024 4, 0.952 3±0.045 5, 0.927 3±0.041 9, 0.865 8±0.028 9, 0.814 3±0.024 7 and 0.759 3±0.220 0, respectively. Compared with group A , the A values of other groups all increased; compared with groups B and C, the A values of groups D, E and F all decreased (allP<0.01). Compared with the blank control group, the protein expression of PI3K and p-Akt in acetaldehyde group and acetaldehyde+LY294002 group were increased (allP<0.01). Compared with the acetaldehyde group, the value of acetaldehyde+LY294002 group decreased (P<0.05). Conclusion PI3K/Akt signaling pathway may partly adjust and control the proliferation of rat HSC-T6 stimulated by acetaldehyde.

hepatic fibrosis; hepatic stellate cell; acetaldehyde; phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt signaling pathway; LY294002

國家自然科學(xué)基金資助項目(81170402)。

張迪(1990-)，女，碩士，主要研究方向為慢性肝病及消化道腫瘤的臨床及基礎(chǔ)。E-mail:351065129@qq.com

鄭勇(1956-)，男，博士，教授，主要研究方向為慢性肝病及消化道腫瘤的臨床及基礎(chǔ)。E-mail:zy2850@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.002

R575.2

A

1002-266X(2016)45-0006-03

2016-08-22)