青島地區(qū)兒童淋巴瘤中EB病毒潛伏膜蛋白1基因變異及意義

岳康，高翔翔，李斐斐，王云

(1 青島大學醫(yī)學院，山東青島266021；2青島大學附屬醫(yī)院；3 青島市城陽區(qū)流亭衛(wèi)生院)

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青島地區(qū)兒童淋巴瘤中EB病毒潛伏膜蛋白1基因變異及意義

岳康1,2，高翔翔3，李斐斐1，王云1

(1 青島大學醫(yī)學院，山東青島266021；2青島大學附屬醫(yī)院；3 青島市城陽區(qū)流亭衛(wèi)生院)

目的 了解青島地區(qū)兒童淋巴瘤中EB病毒(EBV)潛伏膜蛋白1(LMP1)基因多態(tài)性。并探討LMP1變異在兒童淋巴瘤發(fā)生中的意義。方法 采用巢式PCR和DNA測序檢測66例青島地區(qū)EBV陽性兒童淋巴瘤組織中LMP1全長序列，根據其特征性突變和系統(tǒng)進化樹，對基因變異進行分類，并與以往同一地區(qū)成人NK/T細胞淋巴瘤和健康人群中LMP1變異類型的分布進行比較。結果 66例標本完成測序，共發(fā)現3種LMP1亞型，即China 1、China 2和Med-，其構成比分別為84.8%、7.6%和6.1%，另有1例(1.5%)為China 1/China 2重組病毒株。LMP1 N端XhoⅠ位點缺失變異即XhoⅠ(-)和未缺失型XhoⅠ(+)的檢出率分別為93.9%和6.1%；C端30 bp缺失即del-LMP1和未缺失型wt-LMP1的檢出率分別為84.8%和15.2%。兒童淋巴瘤和成人NK/T細胞淋巴瘤中LMP1各亞型的分布差異無統(tǒng)計學意義，但兒童淋巴瘤中China 1亞型、XhoⅠ(-)和del-LMP1的檢出率高于健康人群(P均<0.05)。結論 青島地區(qū)兒童淋巴瘤中LMP1以China 1亞型、XhoⅠ(-)和del-LMP1為主，LMP1變異可能與兒童淋巴瘤的發(fā)生相關。

淋巴瘤；EB病毒；潛伏膜蛋白1；基因多態(tài)性；兒童；青島

EB病毒(EBV)是重要的腫瘤病毒，與多種人類淋巴細胞和上皮細胞性腫瘤的發(fā)生有關。與EBV相關的淋巴細胞性腫瘤包括Burkitt′s淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、NK/T細胞淋巴瘤、免疫缺陷患者的淋巴細胞瘤和T細胞淋巴瘤等[1]。EBV致癌機制尚不明了，由于不同地域不同疾病來源的EBV毒株存在基因變異，EBV基因變異與腫瘤發(fā)生的關系一直是EBV致癌機制研究中的熱點，多種EBV變異型已經被發(fā)現，但EBV基因變異與腫瘤發(fā)生的關系尚未明確。EBV潛伏膜蛋白1(LMP1)基因是重要的病毒癌基因，可以轉化淋巴細胞、角質細胞和成纖維細胞，抑制細胞凋亡，促進腫瘤轉移。LMP1蛋白含386個氨基酸，分為N端胞質區(qū)、跨膜區(qū)和C端胞質區(qū)，基因測序發(fā)現LMP1存在堿基突變、缺失和重復序列拷貝數改變等多種變異。報道較多的為XhoⅠ(-)變異型和del-LMP1變異型。有研究根據不同地域來源的LMP1蛋白發(fā)生的氨基酸突變，將LMP1分為7個亞型，分別為B95-8、China 1、China 2、China 3、Med(包括30 bp缺失的Med+和不缺失的Med-)、NC和Alaskan。以往有關LMP1基因變異與EBV相關淋巴瘤的研究多針對成人淋巴瘤，有研究支持某一LMP1變異型與淋巴瘤形成和發(fā)展有關[2～7];也有研究認為LMP1變異只與地域相關，與疾病的發(fā)生不相關[8,9]。2008年1月～2015年12月，本研究檢測了青島地區(qū)兒童淋巴瘤中LMP1基因全序列，采用不同的分類方法對LMP1變異進行分類，與同一地區(qū)EBV相關成人NK/T細胞淋巴瘤和健康人群數據[7]進行比較，探討LMP1基因變異在兒童淋巴瘤發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 兒童淋巴瘤石蠟包埋組織標本66例份，均取自青島市兒童醫(yī)院、青島大學附屬醫(yī)院和青島市市立醫(yī)院病理科，患者均居住在青島地區(qū)，籍貫青島。均通過腫塊活檢確診。男39例、女27例，年齡1～17歲。HL 26例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)40例，其中NHL包括T淋巴細胞母細胞淋巴瘤16例、B淋巴細胞母細胞淋巴瘤8例、Burkitt′s淋巴瘤 6例、彌漫性大B細胞淋巴瘤3例、間變大細胞性淋巴瘤4例、濾泡性淋巴瘤1例和NK/T細胞淋巴瘤2例。

1.2 LMP1序列的檢測 采用PCR產物直接測序法。每例淋巴瘤石蠟包埋組織標本取10 μm切片8張，采用FFPE石蠟包埋組織DNA提取試劑盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)提取DNA，提取步驟按照試劑盒說明書進行。設計合成擴增LMP1全長序列的引物，采用巢式PCR擴增LMP1序列，引物序列及PCR擴增條件見參考文獻[7]。采用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增條帶，以內巢PCR引物作為測序引物，采用末端終止法對內巢PCR擴增產物進行雙向測序，測序反應由北京華大基因有限公司完成。測序成功后，用Chromas軟件查看峰圖文件；以EBV標準株B95-8為參照序列，通過DNAStar軟件(Lasergene，version 7.0)對序列進行比對分析。

1.3 LMP1全長序列分析 LMP1編碼基因包括3個外顯子和2個內含子，對1.2中獲得的DNA序列，采用DNAStar軟件剪切和拼接，翻譯成蛋白序列。采用MEGA 5.0軟件用Clastal W方法將本研究所獲得LMP1蛋白序列以及GenBank中發(fā)表LMP1亞型(B95-8、China 1、China 2、China 3、Med-、NC和Alaskan)代表序列進行同源性分析，繪制系統(tǒng)進化樹，根據其特征性突變及系統(tǒng)進化樹確定LMP1變異類型，并分析其XhoⅠ(-)和del-LMP1變異情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數資料以率或百分比表示。兒童淋巴瘤和以往成人NK/T細胞淋巴瘤及健康人群LMP1基因變異類型的分布差異采用χ2檢驗或精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LMP1變異類型 和標準株B95-8比對，66例測序成功的樣本均出現核苷酸和氨基酸序列改變。N端胞質區(qū)(aa1-24)和跨膜疏水結構區(qū)(aa25-186)只發(fā)生堿基突變，N端第17位氨基酸出現核苷酸t(yī)→g突變導致XhoⅠ酶切位點丟失，即為XhoⅠ(-)變異；C端胞質區(qū)(aa187-386)除堿基突變外，還出現2處缺失(aa343-352 GGGHSHDSGH缺失即30 bp缺失和aa276-280 HDPLP缺失，后者位于下述第2和3重復序列之間)以及重復序列(aa 254 后11個aa QDPDNTDDNGP)拷貝數變化。通過序列比對及系統(tǒng)進化樹分析，在66例份淋巴瘤樣本中共發(fā)現3種LMP1亞型，即China 1、China 2和Med-。China 1亞型56例(84.8%，56/66)，其40處共有突變與China 1代表序列一致；China 2亞型5例(7.6%，5/66)，出現48處共有突變，除缺乏錯義突變E128D和同義突變a168361g(aa230)外，其余突變與China 2代表序列相同；Med-亞型4例(6.1%，4/66)，出現14處共有突變，除增加了G212S突變外，其余突變與Med代表序列相同。每一亞型的標本序列中，少數標本在1～3個共有突變位點不發(fā)生突變或出現不同突變。所有China 1序列為XhoⅠ(-)/del-LMP1，China 2為XhoⅠ(-)/wt-LMP1，Med-為XhoⅠ(+)/wt-LMP1。另外還有1例標本(NHL16)在重復序列之前為China 1亞型特征，重復序列后為China 2亞型特征，為China 1/China 2重組株，分類為“Recombinant grouped”(RG)組，呈XhoⅠ(-)/wt-LMP1變異。除共有突變外，多數樣本還伴有1～3處其他位點的散在突變。在重復序列區(qū)，樣本均缺失第2和3重復序列之間的5個氨基酸。B95-8重復序列拷貝數為4，China 1亞型重復序列拷貝數為2～7拷貝，最多見的為5拷貝，其次為6和4拷貝；China 2亞型為2、3或4拷貝；Med-亞型為3、4或5拷貝；重組病毒株NHL16為3拷貝。在重復序列的11個氨基酸中，China 1亞型毒株很少出現突變，而4例Med-亞型標本均出現突變1處或2處，5例China 2樣本中出現1處突變4例。

2.2 LMP1變異類型在兒童淋巴瘤中的分布 兒童淋巴瘤中不同LMP1變異型的分布見表1。3種變異分類的LMP1變異型分別以China 1、XhoⅠ(-)和del-LMP1為主。與以往我們檢測的同一地區(qū)數據[7]比較，3種變異分類的LMP1變異型在兒童淋巴瘤和成人NK/T細胞淋巴瘤中的分布差異無統(tǒng)計學意義，而兒童淋巴瘤與健康人群中的分布差異有統(tǒng)計學意義(亞型：P=0.015；XhoⅠ位點：P=0.002；30 bp缺失：P=0.016)，兒童淋巴瘤中China 1、XhoⅠ(-)和del-LMP1的檢出率均高于健康人群(P均<0.05)。成人NK/T細胞淋巴瘤中China 1、XhoⅠ(-)和del-LMP1的檢出率亦均高于健康人群(亞型：P=0.022；XhoⅠ位點：P=0.003；30 bp缺失：P=0.029)[7]。

表1 LMP1各變異型在兒童淋巴瘤、成人NK/T細胞淋巴瘤及健康人群中的分布[例(%)]

3 討論

本研究對青島地區(qū)66例兒童淋巴瘤中LMP1基因全序列進行了檢測及分析，采用不同的分類方法對LMP1變異進行分類，并比較不同變異分類之間的對應關系，全面真實地反映了兒童淋巴瘤中LMP1基因變異情況。以往針對LMP1基因多態(tài)性的研究，多數只檢測XhoⅠ(-)和(或)del-LMP1變異，測序研究也只檢測C末端一段較短的序列，而結合我們的結果和LMP1各亞型的代表序列，可以發(fā)現XhoⅠ(-)變異可見于China 1、China 2、Alaskan和NC亞型，XhoⅠ(+)見于B95-8、Med+和Med-亞型；del-LMP1見于China 1和Med+亞型，其余亞型均為wt-LMP1。另外，本研究還檢測到重組病毒株1例，以往在口腔扁平苔癬、成人NK/T細胞淋巴瘤、NPC和健康人群中也檢測到重組病毒株[2,7,10,11]。重組病毒株的LMP1序列具有不同亞型的特征性改變，使LMP1亞型與XhoⅠ位點和30 bp缺失變異的關系更復雜。而且在C末端11個氨基酸重復序列區(qū)域，不同標本重復次數從2～7不等，不同亞型也呈現不同變異。以往有研究還發(fā)現了LMP1新亞型SEA1和SEA2[6]以及69 bp(aa333-355)缺失序列[12]。由此可見，LMP1變異復雜多變，在分析LMP1變異時，不能只檢測XhoⅠ(-)變異和(或)del-LMP1變異，最好針對LMP1基因全序列進行檢測分析，才能準確反映LMP1變異情況。

本研究青島地區(qū)兒童淋巴瘤以China 1、XhoⅠ(-)和del-LMP1變異為主，這與該地區(qū)EBV相關NPC、胃癌、成人NK/T細胞淋巴瘤及健康人群[7,10]類似，也與亞洲其他地域如北京、日本和中國南方等地域NPC和成人淋巴瘤[2,3,8,9,13,14]一致。目前只有少數研究對兒童淋巴瘤中LMP1基因多態(tài)性進行了研究，Santón等[15]報道del-LM1在24例西班牙兒童淋巴瘤和22例健康兒童中的檢出數分別為19(79.2%)和8例(36.4%)，其中分別有12例淋巴瘤和6例健康兒童為del-LMP1和wt-LMP1混合感染。Lorenzetti等[16]檢測來自阿根廷的20例EBV陽性兒童淋巴瘤和15例傳染性單核細胞增多癥(IM)，淋巴瘤中del-LMP1的檢出率為65.0%(13/20)，China 1、Med-、Alaskan和B95-8亞型的檢出數分別為13、2、4、1例；而IM中del-LMP1的檢出率為53.3%(8/15)，China 1、Med-、China 2、Med-&China 2混合感染以及Med-&China 3混合感染的檢出數分別為7、4、2、1、1例。謝正德等[17]的結果顯示，del-LMPl在北京地區(qū)25例兒童HL、8例NHL和15例淋巴結反應性增生疾病中的檢出數分別為11(44.0%)、3(37.5%)和5例(33.3%)。本研究China 1和del-LMP1在兒童淋巴瘤中的檢出率高于西班牙和阿根廷病例，可能與地域分布有關，因為以往研究表明China 1和del-LMP1是亞洲人群的主要亞型[2,7,10,13,14]，而與北京地區(qū)兒童淋巴瘤檢出率的不同可能與地區(qū)差異及北京地區(qū)病例數較少有關。

本研究與以往同一地區(qū)不同人群數據比較表明，兒童淋巴瘤和成人NK/T細胞淋巴瘤LMP1變異類型分布比例相差不大，但健康人群中China 1、del-LMP1和XhoⅠ(-)的檢出率低于兒童淋巴瘤，提示China 1亞型病毒株可能與兒童淋巴瘤的發(fā)生相關。Santón等[15]的研究表明，del-LMP1在兒童淋巴瘤的檢出率(79.2%)高于健康兒童(36.4%)，提示del-LMP1與兒童淋巴瘤有關。Lorenzetti等[16]認為兒童淋巴瘤和IM中LMP1變異類似，但與該地區(qū)健康人群(成年人群)不同，從而認為LMP1變異既與淋巴瘤相關，也與IM相關。謝正德等[17]認為，del-LMP1在EBV陽性的兒童HL、NHL和淋巴結反應性增生病例中的分布相同，與疾病本身沒有關系。關于LMP1變異與疾病的相關性，目前流行病學研究和功能學研究均未獲得一致結論[13]。但有不少流行病學研究發(fā)現，腫瘤組織中XhoⅠ(-)變異和(或)del-LMP1變異高于對照人群，認為LMP1變異與腫瘤相關[3～7,15]。也有功能學研究表明，China 1亞型LMP1致癌能力和免疫逃逸能力增強，容易出現在NPC和HL等腫瘤中[5,18]。目前有關兒童淋巴瘤中LMP1變異的研究較少，樣本例數偏少且缺乏合適的對照人群，LMP1基因變異與兒童淋巴瘤發(fā)生的確切關系有待進一步闡明。

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Gen mutations of Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein 1 in pediatric lymphomas of Gingdao area

YUEKang1,GAOXiangxiang,LIFeifei,WANGYun

(1MedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266021,China)

Objective To understand the gene polymorphisms of Epstein-Barr virus (EBV)-encoded latent membrane protein 1 (LMP1) gene in pediatric patients with lymphoma from Qingdao area and to investigate the significance of LMP1 in the development of pediatric lymphomas. Methods Nested-PCR and DNA sequencing were used to analyze the gene sequences of LMP1 in isolates from 66 cases of EBV-positive samples of children with lymphomas. The sequences of LMP1 were classified according to the signature changes and the phylogenetic tree. The distribution of LMP1 variants in pediatric lymphoma cases was compared with the previous data from adult NK/T cell lymphoma cases and healthy donors in the same area. Results Three subtypes of LMP1 gene, China 1, China 2 and Med-, were observed in 66 isolates, with distribution of 84.8%, 7.6% and 6.1%, respectively. Another 1 (1.5%) isolate was recombinant strain of China 1 and China 2. The frequencies of XhoI(-) variant (loss XhoI site in N-terminus of LMP1) and prototype XhoI(+) were 93.9% and 6.1%, respectively, and those of del-LMP1 variant (30 bp deletion in C-terminus of LMP1) and prototype wt-LMP1 were 84.8% and 15.2%, respectively. The distribution of LMP1 variants in pediatric lymphoma was similar to that in adult NK/T cell lymphoma, while the frequency of China 1, XhoI(-) or del-LMP1 in children with lymphoma was significantly higher than that in healthy donors (allP<0.05). Conclusion China 1, XhoI(-) and del-LMP1 are the major LMP1 subtypes in pediatric lymphomas from Qingdao and may associate with the susceptibility of pediatric lymphomas.

lymphoma; Epstein-Barr virus; latent membrane protein 1; gene polymorphism; child; Qingdao

國家自然科學基金資助項目(81171571);青島市科技計劃項目(13-1-3-50-nsh)。

岳康(1985-)，男，碩士研究生,主要研究方向EB病毒基因多態(tài)性。E-mial：yuekang373657@126.com

王云(1970-))，女，教授,主要研究方向為EB病毒致癌機制。E-mial：qdwangyun@aliyun.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.006

R373

A

1002-266X(2016)45-0019-04

2016-08-09)