2,3-吲哚醌對神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y侵襲轉移的影響及機制

魏堯悅，侯琳

(青島大學醫學院生物化學與分子生物學教研室, 山東青島 266021)

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2,3-吲哚醌對神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y侵襲轉移的影響及機制

魏堯悅，侯琳

(青島大學醫學院生物化學與分子生物學教研室, 山東青島 266021)

目的 探討2,3-吲哚醌對神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y侵襲轉移的影響及機制。方法 體外培養SH-SY5Y細胞，用不同濃度(50、100、200、300 μmol/L)的2,3-吲哚醌處理細胞48 h, 并設不加藥物處理的細胞作為對照組，CCK-8法檢測細胞活性，篩選合適的2,3-吲哚醌濃度；用吖啶橙染色法檢測對照組和 200 μmol/L 2,3-吲哚醌處理組(加藥組)的自噬溶酶體細胞數量；將細胞分別用50、100、200、300 μmol/L 2,3-吲哚醌處理(加藥組)，并設空白對照,48 h后用Western blotting法檢測自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ的表達水平,Transwell小室試驗檢測細胞的侵襲能力，劃痕試驗檢測細胞遷移能力。結果 與對照組相比，隨著2,3-吲哚醌濃度的升高，細胞A450值降低，藥物對細胞的抑制率升高(P<0.05或<0.01)。吖啶橙染色結果顯示，與對照組相比，加藥組產生自噬溶酶體的細胞數增多(P<0.01)。Western blotting結果顯示，與空白對照比較，隨著藥物濃度增加，加藥組LC3-Ⅱ表達增多(P<0.05或<0.01);Transwell小室試驗和劃痕試驗表明，隨著2,3-吲哚醌濃度的增加，SH-SY5Y細胞侵襲轉移能力逐漸減弱(P均<0.05)。結論 2,3-吲哚醌可能通過誘導神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y自噬,從而抑制其侵襲轉移。

神經母細胞瘤；SH-SY5Y細胞；2,3-吲哚醌；侵襲；轉移

神經母細胞瘤是兒童最常見實體瘤，近50%發生在一歲左右的嬰幼兒[1]，其起源于胚胎期交感神經系統神經嵴細胞，是小兒癌癥死亡的首要原因，占所有兒童癌癥病死率的13%[2]。神經母細胞瘤的最顯著特點是其臨床異質性，約有一半的病例被列為高風險，盡管使用多種方法治療仍然只有40%左右的生存率[1]。2,3-吲哚醌不僅作為一種海洋活性藥物發揮抗癌作用，而且是人體內源性物質，其具有多種藥理學活性，如保護神經、抗菌、抗病毒等[3]。研究表明，2,3-吲哚醌可以抑制神經母細胞瘤細胞侵襲轉移，其機制可能與下調MMP-2和MMP-9表達有關[4]，但未見有關2,3-吲哚醌對神經母細胞瘤細胞自噬及侵襲轉移影響的報道。2015年9月～2016年7月，我們觀察了2,3-吲哚醌對SH-SY5Y細胞自噬及侵襲轉移的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y(購自中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫)。試劑與儀器：2,3-吲哚醌(Sigma公司)；DMEM培養基(Hyclone公司)；Gibco胎牛血清(青島浩賽科技有限公司)；青鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶消化液(北京索萊寶科技有限公司)；甘氨酸、Tris堿、牛血清白蛋白(BSA)(上海生工生物工程有限公司)；6×Protein Loading Buffer(北京全式金生物技術有限公司)；Tris 8.8緩沖液、Tris 6.8緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、過硫酸銨(Sigma公司)；苯甲基磺酰氟(武漢博士德生物工程有限公司)；Protein Marker(北京全式金生物技術有限公司)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(MILLIPORE公司)；BCA蛋白質定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗人LC3B單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體(Abcam公司)；垂直電泳儀、濕法轉膜儀(Bio-Rad公司)；發光呈像系統(型號Fusion FX7)；增強型化學發光試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)；細胞培養瓶、6孔板、24孔板、96孔板(Thermo Fisher公司)；吖啶橙(AO)(Sigma公司)；Transwell小室(Corning公司)；Matrigel基質膠(BD公司)；超凈工作臺(蘇凈安泰公司)；CO2培養箱(Thermo Fisher公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司)；熒光顯微鏡(Olympus公司)；超速離心機(Eppendorf公司)；pH計(上海雷磁儀器廠)；-80 ℃超低溫冰箱(Thermo Fisher公司)。

1.2 人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y體外培養 人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y在含10%胎牛血清的DMEM培養基(含青霉素100 kU/L，鏈霉素100 μg/mL)，37 ℃、5% CO2、飽和濕度環境下，使用培養皿連續培養，細胞達80%～90%融合度時，用0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代。

1.3 不同濃度2,3-吲哚醌對SH-SY5Y細胞抑制率影響的檢測 采用CCK-8法。取大約90%融合的細胞，用胰蛋白酶消化，吹打均勻，調整密度，每孔加細胞懸液100 μL，接種到96孔板。設置5個復孔。待細胞完全貼壁，進入對數生長期后，更換新的血清濃度為10%的DMEM培養基，并加入2,3-吲哚醌至終濃度50、100、200、300 μmol/L,對照組不加藥物處理。作用48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養箱孵育2 h。450 nm測定吸光度，并進行統計分析。

1.4 2,3-吲哚醌處理后SH-SY5Y細胞自噬溶酶體的檢測 采用AO染色法。取對數期生長的細胞接種于6孔板，24 h后加200 μmol/L 2,3-吲哚醌(加藥組)處理，對照組不做藥物處理，作用48 h后，把藥物處理好的細胞用PBS清洗2次，用0.25%的胰蛋白酶消化制成細胞懸液，將細胞懸液以1 000 r/min離心3 min后棄上清，加PBS把細胞調至1×105～10×105/mL吹打混勻，取300 μL吸到EP管中，加入AO 3 μL，37 ℃避光孵育15 min。加PBS 0.5 mL,1 500 r/min、4 ℃、離心5 min，收集細胞，棄上清。然后用PBS 1 mL 把細胞沉淀打散，同樣條件離心，去PBS,再加PBS 1 mL洗2次。最后一次離心后，留下少量液體約10 μL滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片在熒光倒置顯微鏡上(放大倍數20倍藍光激發)觀察拍照。熒光顯微鏡下觀察到的橘紅色點狀體即自噬囊泡。

1.5 SH-SY5Y細胞LC3-Ⅱ蛋白相對表達的檢測 采用Western blotting法。取對數期生長細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后加2,3-吲哚醌(藥物濃度分別為100、200、300 μmol/L)處理48 h，提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，8%分離膠和10%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，然后轉膜，封閉液室溫封閉2 h，加β-actin和LC3B一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。然后用1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗孵育1 h，再次用1×TBST洗膜10 min，重復3次。最后將ECL發光液按說明書加到PVDF膜上，室溫放置1 min，放入成像系統顯影并拍照。以內參GAPDH條帶的灰度值比較目的蛋白的表達。

1.6 SH-SY5Y細胞侵襲能力的檢測 采用Transwell小室試驗。將Matrigel 基質膠與無血清培養液按1∶6 配制后每孔50 μL加入Transwell 小室，放入CO2培養箱中1 h使基質膠凝固。吸出Transwell 小室中未凝固的培養基，加入50 μL 含10 mg/mL BSA 的無血清培養液，37 ℃、30 min。取對數期生長細胞加2,3-吲哚醌處理(藥物濃度分別為100、200、300 μmol/L)，消化細胞，配成細胞懸液；每孔上室加入 200 μL細胞懸液和2,3-吲哚醌；下腔室中加入 600 μL 10%胎牛血清DMEM培養基后放入 37 ℃ 培養箱中，孵育24 h。對照組加入無血清培養基培養24 h。取出 Transwell小室 用 PBS 洗 2 遍， 5%甲醛固定， 再用PBS 洗 2 遍，加入0.1%結晶紫染色，室溫 0.5 h ， PBS 洗 2 遍，用棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下拍照計數。

1.7 SH-SY5Y細胞遷移能力的檢測 采用細胞劃痕試驗。將細胞接種于6 孔板,待細胞貼壁后,用1 000 μL 規格的槍頭在孔板底部劃十字,用PBS洗凈刮下的細胞, 換上新的培養基后加入濃度梯度分別為100、200、300 μmol/L的2,3-吲哚醌處理，并設空白對照，37 ℃培養箱中繼續培養。分別觀察12、24、48 h同一視野下劃痕處細胞遷移的距離并拍照對比分析。

2 結果

2.1 不同濃度2,3-吲哚醌對SH-SY5Y細胞抑制率的影響 對照組及2,3-吲哚醌濃度為50、100、200、300μmol/L時，細胞A450值分別為1.610±0.050、 1.580±0.031、1.540±0.045、1.443±0.094、1.242±0.053，細胞抑制率分別為0、5.370%±0.431%、21.160%±1.738%、32.280%±0.924%、55.740%±1.708%。與對照組比較，隨著2,3-吲哚醌濃度的升高，A450值降低，藥物對細胞的抑制率升高(P<0.05或<0.01)。

2.2 2,3-吲哚醌對SH-SY5Y細胞自噬溶酶體形成的影響 200μmol/L2,3-吲哚醌處理SH-SY5Y細胞48h,AO染色后可見經2,3-吲哚醌處理的SH-SY5Y細胞出現較多的紅色點狀聚集。加藥組及對照組的自噬細胞陽性率分別為81.397%±3.856%、13.333%±1.528%，兩者比較，P<0.01。

2.3 不同濃度2,3-吲哚醌處理后LC3-Ⅱ蛋白的表達 空白對照及100、200、300μmol/L2,3-吲哚醌處理48h后SH-SY5Y細胞LC3-Ⅱ水平分別為0.17±0.04、0.41±0.11、0.59±0.26、0.78±0.19，與空白對照比較，隨著2,3-吲哚醌濃度升高，SH-SY5Y細胞LC3-Ⅱ表達升高(P<0.05或<0.01)。

2.4 不同濃度2,3-吲哚醌對細胞侵襲能力的影響 空白對照及100、200、300μmol/L2,3-吲哚醌處理48h后發生侵襲的SH-SY5Y細胞數分別為(327.33±26.63)、(185.67±11.24)、(147.33±2.52)、(75.33±6.03)個，SH-SY5Y細胞抑制率分別為0、43.11%±4.37%、54.80%±3.59%、76.99%±0.23%，與空白對照相比，不同濃度2,3-吲哚醌(100、200、300μmol/L)穿過Matrigel基質小室的SH-SY5Y細胞數量隨藥物濃度的升高而減少，細胞抑制率升高(P均<0.01)。

2.5 不同濃度2,3-吲哚醌對細胞遷移能力的影響 與對照相比，同一作用時間下，隨著2,3-吲哚醌濃度的升高，細胞遷移能力減弱(P均<0.05)；隨著作用時間的延長(12、24、48h)，同一濃度下，2,3-吲哚醌對細胞的抑制作用逐漸增強(圖1)。

注：與空白對照同時點比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖1 2,3-吲哚醌對細胞遷移的抑制作用

3 討論

腫瘤的侵襲和轉移是惡性腫瘤的主要特征,也是影響治療結果和預后的重要因素[5]。神經母細胞瘤惡性程度高，預后差，不同神經母細胞瘤患者預后差別很大。大多數神經母細胞瘤患者死亡的主要原因是淋巴轉移和骨轉移[6,7]，因此抑制神經母細胞瘤的侵襲和轉移是其治療的關鍵。2,3-吲哚醌毒性低、不良作用小。諸多研究表明，2,3-吲哚醌可以抑制腫瘤血管生成，促進SH-SY5Y細胞凋亡，抑制其增殖、侵襲轉移等[8～10]。本試驗通過Transwell小室試驗和劃痕試驗分別檢測細胞侵襲和遷移能力,結果提示，2,3-吲哚醌能顯著抑制神經母細胞瘤細胞的侵襲和遷移能力，且抑制能力隨藥物濃度的升高和作用時間的增加而增強。

自噬是真核細胞普遍存在的一種現象，是細胞受到外界或內在刺激發生的一種應激反應，是細胞用來達到動態平衡的重要機制之一[11]。自噬在腫瘤形成和發展中扮演抑制和促進的雙重角色；自噬一方面通過質量控制功能抑制慢性組織損傷和炎性反應以及維持基因穩定來抑制腫瘤，另一方面通過營養回收維持腫瘤生長代謝從而促進腫瘤存活[12]。雖然自噬對腫瘤發生發展具有雙重作用, 但由于多數腫瘤細胞自噬能力降低,因此,自噬的缺陷可能是導致腫瘤發生、發展的重要機制, 誘導腫瘤細胞自噬性死亡是治療腫瘤的潛在途徑[11]。 LC3 是哺乳動物細胞中酵母Atg8基因的同源物，有兩種形式：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ， LC3-Ⅰ在細胞內，而LC3-Ⅱ與細胞膜結合。LC3-Ⅰ是新合成的pre-LC3經過剪切修飾除去C末端22個氨基酸構成的，隨后LC3-Ⅰ的一小部分轉化為LC3-Ⅱ。因此，LC3-Ⅱ的表達量與自噬程度相關[13]。本試驗通過AO染色和Western blotting法分別在細胞水平和蛋白水平檢測2,3-吲哚醌對神經母細胞瘤細胞自噬作用的影響。結果顯示，與對照組相比，加藥組產生自噬溶酶體的細胞數顯著增多；Western blotting結果顯示，隨著藥物濃度的增加，自噬標志蛋白LC3-Ⅱ表達量顯著增多，提示2,3-吲哚醌能促進神經母細胞瘤細胞自噬。

綜上所述，2,3-吲哚醌可能通過促進神經母細胞瘤細胞自噬來抑制其侵襲轉移。然而，自噬和侵襲轉移是非常復雜的過程，2,3-吲哚醌對神經母細胞瘤細胞自噬的具體機制以及其與侵襲轉移之間的關系，仍待進一步研究。

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Effect of 2,3-isatin on invasion and metastasis of neuroblastoma SH-SY5Y cells and its mechanism

WEIYaoyue,HOULin

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266021,China)

Objective To investigate the effect of 2,3-isatin on the invasion and metastasis of neuroblastoma SH-SY5Y cells and the mechanism. Methods SH-SY5Y cells cultured in vitro were treated for 48 h with different concentrations of 2,3-isatin (25, 50, 100, 200 and 300 μmol/L). The cell viability was measured by CCK-8. The number of cells with autolysosome in the control group and 200 μmol/L isatin-treated group was detected by acridine orange staining fluorescence. The expression of LC3 Ⅱ, a marker protein for autophagy was examined by Western blotting. The invasion of SH-SY5Y cells was tested by Transwell assay and the motile ability was detected by Scratch test.Results Compared with the control group, the A450 value decreased and the inhibition rate increased when the concentration of 2,3-isatin was higher than 100 μmol/L (P<0.05 orP<0.01). AO staining showed that the number of autolysosomes increased in the 200 μmol/L 2,3-isatin treatment group as compared with that of the control group (P<0.01). Western blotting showed that the expression of LC3-Ⅱincreased with the increasing drug concentration (P<0.05). Transwell assay and Scratch test showed that the invasion and motile abilities of SH-SY5Y cells diminished with the increasing concentration of 2,3-isatin (allP<0.05). Conclusion 2,3-isatin may inhibit the invasion and metastasis of SH-SY5Y cells by inducing the autophagy.

neuroblastoma; SH-SY5Y cells; 2,3-isatin; invasion; metastasis

國家自然科學基金項目( 81472542)。

魏堯悅(1990- )，女，碩士，主要研究方向為抗腫瘤藥物。E-mail:hanyue810713791@163.com

侯琳(1962- )，女，教授，博士研究生導師，主要研究方向為腫瘤分子生物學。E-mail：qingdaodxyy@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.007

R739.4

A

1002-266X(2016)45-0023-04

2016-08-19)