拉米夫定對人肝癌細胞MMP-9及p53蛋白表達的影響

王雪，楊偉，李靖，馬存花

(1勝利油田中心醫院，山東東營257000；2中國人民解放軍第89醫院；3濰坊醫學院)

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拉米夫定對人肝癌細胞MMP-9及p53蛋白表達的影響

王雪1，楊偉2，李靖2，馬存花3

(1勝利油田中心醫院，山東東營257000；2中國人民解放軍第89醫院；3濰坊醫學院)

目的 探討拉米夫定作用于人肝癌細胞系HepG2.2.15后對細胞中基質金屬蛋白酶9(MMP-9)及p53蛋白表達的影響。方法 不同濃度(100、200、300 μg/mL)拉米夫定(拉米夫定100、200、300 μg/mL組)作用于HepG2.2.15細胞不同時間(3、6 d)，并設立不應用拉米夫定的HepG2.2.15細胞作為對照組。MTT比色法測定細胞增殖活性；ELISA法測定細胞培養上清及細胞中MMP-9及p53蛋白相對表達量。結果 拉米夫定100、200、300 μg/mL組與對照組不同時間細胞增殖活力比較差異無統計學意義(P均>0.05)。作用3、6 d，與對照組比較，拉米夫定各處理組HepG2.2.15細胞及其培養液中MMP-9及p53蛋白表達水平均明顯降低(P均<0.05)。結論 拉米夫定作用后HepG2.2.15細胞MMP-9及p53蛋白水平降低。

肝腫瘤；HepG2.2.15細胞；基質金屬蛋白酶9；p53蛋白；拉米夫定

肝癌(HCC)是臨床常見、惡性程度較高的腫瘤。在亞洲和非洲，HCC發病主要與感染乙肝病毒(HBV)有關[1]。HCC的特點是早期轉移，由腫瘤細胞和微環境中分泌的生物分子，如基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、p53，在其發展和轉移的關鍵環節發揮了重要作用。拉米夫定作為核苷類似物,可通過終止HBV DNA鏈合成抑制HCC發展[2]。2015年6月～2016年5月，本研究用拉米夫定作用于人HCC細胞系HepG2.2.15，對其細胞內和細胞培養上清液中MMP-9及p53蛋白表達進行檢測，探討拉米夫定治療HCC的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人HCC細胞系HepG2.2.15(上海博谷生物科技有限公司)，α-MEM培養基、胎牛血清(Gibco)，G418(北京格林博遠生物科技有限公司)，胰蛋白酶/EDTA、青鏈霉素混合液、PBS、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(北京Solarbio公司)，拉米夫定(葛蘭素史克公司)，MMP-9及p53試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)。

1.2 細胞培養及分組 常規復蘇HepG2.2.15細胞，用含10%胎牛血清的α-MEM培養基(含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL、G418 200 μg/mL)，于5% CO2、37 ℃孵育箱中培養。3～4 d更換1次培養基。待細胞生長至80%～90%融合度時使用胰蛋白酶/EDTA消化，按比例1∶3傳代。取對數期HepG2.2.15細胞，用胰蛋白酶/EDTA消化，細胞計數，調整細胞懸液濃度，按照104/孔接種于96孔板。設對照組(加細胞、培養基)和拉米夫定100、200、300 μg/mL組。拉米夫定100、200、300 μg/mL組添加不同濃度(100、200、300 μg/mL)拉米夫定200 μL。每組設5個復孔，于5% CO2、37 ℃孵育箱中培養。

1.3 細胞增殖活力的檢測 采用MTT法。分別于拉米夫定干預后0、2、4、6、8 d采用MTT法測定每組細胞增殖情況。操作：吸棄上清，加入無血清培養基90 μL及MTT 10 μL，于5% CO2、37 ℃孵育箱中培養4 h。吸棄上清，每孔加入Formazan溶解液110 μL，振蕩10 min，待結晶物充分溶解后，用酶標儀測各孔波長490 nm處吸光度(A)值，計算均值。

1.4 細胞及其培養上清液中MMP-9、p53蛋白表達檢測 采用ELISA法。分別于拉米夫定干預后3、6 d收集細胞及其上清液。胰酶消化回收細胞，12 000 r/min離心5 min后棄上清液，加PBS 200 μL重懸。液氮 37 ℃水浴反復凍融法裂解細胞，重復3次。12 000 r/min離心10 min，留取上清液，-70 ℃凍存。嚴格按照ELISA試劑盒說明書測定細胞及培養上清液中MMP-9、p53蛋白表達。

2 結果

2.1 各組不同時間細胞增殖活力比較 拉米夫定100、200、300μg/mL組與對照組不同時間細胞增殖活力比較差異無統計學意義(P均﹥0.05)。見表1。

表1 各組不同時間細胞增殖活力比較

2.2 各組細胞及其培養上清液中MMP-9、p53蛋白表達比較 干預后第3、6天，與對照組比較，拉米夫定各處理組HepG2.2.15細胞及其培養上清液中MMP-9、p53蛋白表達水平均降低(P均<0.05)。見表2、3。

表2 各組細胞及其上清液中MMP-9蛋白表達比較

注：與對照組同時點比較，*P<0.05。

表3 各組細胞及其上清液中p53蛋白表達比較

注：與對照組同時點比較，*P<0.05。

3 討論

VEGF可以增強細胞通透性，尤其是微小血管的通透性，引起血漿蛋白滲漏到細胞外基質，在細胞外基質中沉著，為成纖維細胞和血管內皮細胞的遷入提供條件基質，為腫瘤細胞的生長和新生毛細血管網的建立提供營養。MMP-9作為一種明膠酶，可以有效降解細胞外基質中Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠。研究發現，MMP-9與多種惡性腫瘤侵襲轉移存在一定的關系[3～5]。Riedel等[6]報道,MMP-9可作為腫瘤血管形成的調控因素參與腫瘤血管形成。其發揮作用時能在細胞表面激活MMP-2，并促進MMPs家族其他因子的活化，共同發揮降解細胞外基質的作用[7,8]。在腫瘤細胞復雜的轉移和浸潤過程中，MMP-9可通過刺激腫瘤細胞遷移、侵襲，促進血管生成而在腫瘤的發生發展中起核心作用[9,10]。有研究發現，MMP-9與HCC、膠質瘤、乳腺癌等多種腫瘤的浸潤、轉移和術后復發相關[11,12]。此外，MMPs還可以增強血管生長因子的作用，促進新生血管形成[13，14],已逐漸成為抗腫瘤治療中重要的藥物作用靶點。p53基因是目前研究較早的抑癌基因，分為突變型和野生型。野生型p53是抑癌基因，對細胞增殖起負調控作用。野生型p53突變后失去抑癌基因功能,并且與野生型p53結合成復合物，抑制p53基因功能,導致細胞異常增殖，可誘導一些異常基因表達，促進腫瘤發生；可以下調抑制血管增生的凝血酶的反應素-1和上調促血管增生的VEGF，因而成為調控腫瘤血管形成的重要因素。

HCC的特點是早期轉移，MMP-9及p53基因在其中起了關鍵作用。HBV是HCC公認的致病因子，它在細胞內的復制有可能激發p53，使其表達升高、功能增強，進而可能導致細胞某些生物學活性(如細胞凋亡、細胞周期等)改變。有研究證實，p53失活與MMP-9的表達在HCC發展中起協同作用。Franchi等認為，p53的突變可以上調MMP-9基因轉錄，并且通過NOS和EGFR途徑影響MMP-9的表達。本試驗中，拉米夫定各處理組與對照組細胞增殖活力差異無統計學意義，而拉米夫定各處理組細胞及上清液中p53及MMP-9蛋白的表達均降低，提示拉米夫定并不是通過直接抑制腫瘤細胞的增殖來抑制腫瘤生長，而是通過某種機制導致p53、MMP-9的表達降低進而抑制HCC的侵襲轉移。試驗結果提示：核苷類藥物不僅可以抑制HBV復制，還可能通過某種機制降低p53及MMP-9的表達，從而抑制HCC的發生和進展。

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楊偉(E-mail:ywcyw723@sina.com)

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R735.7

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1002-266X(2016)45-0043-03

2015-09-28)