丹參素對高糖環境下心肌細胞的保護作用及其機制

李顯輝

(天津市第三中心醫院，天津 300170)

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丹參素對高糖環境下心肌細胞的保護作用及其機制

李顯輝

(天津市第三中心醫院，天津 300170)

目的 探討丹參素對高糖環境下心肌細胞損傷的保護作用及其機制。方法 取指數生長期的H9C2細胞，隨機分為6組，A組使用10% FBS低糖(5 mmol/L葡萄糖)DMEM培養基，B組使用含10% FBS及高糖(30 mmol/L葡萄糖)DMEM培養基，C、D、E、F組在B組培養液基礎上分別加2、4、8、16 mg/L丹參素。培養20 h后采用CCK-8法檢測H9C2細胞的活力，培養18 h后采用生化法檢測細胞培養液中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的含量，ELISA法檢測細胞培養液中IL-6、IL-1β、TNF-α、單核細胞趨化因子1(MCP1)及巨噬細胞移動抑制因子(MIF)的含量，培養18 h后采用實時熒光定量PCR法檢測H9C2細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2 mRNA表達。結果 與A組比較，B組A450值明顯下降(P<0.05)；細胞培養液中LDH、CK、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量增加，SOD、GSH-Px含量降低(P均<0.05)；H9C2細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA相對表達水平上升，Bcl-2 mRNA相對表達水平下降(P均<0.05)。與B組比較，C、D、E、F組A450值升高(P均<0.05)；細胞培養液中LDH、CK、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量低，SOD、GSH-Px含量高(P均<0.05)；H9C2細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達水平不同程度地降低，Bcl-2 mRNA表達水平不同程度升高(P均<0.05)。結論 丹參素對于高糖環境下的H9C2細胞具有保護作用，其機制與減輕細胞氧化應激損傷，降低炎性因子和凋亡基因表達有關。

心肌細胞損傷；丹參素；炎癥反應；細胞凋亡

糖尿病心肌病(DCM)是持續性高血糖所引起的多系統組織器官損害而出現的主要并發癥。持續的高血糖可誘導心肌細胞產生氧化應激損傷、慢性炎癥反應及細胞凋亡等，導致心臟結構重塑、機械功能障礙、心肌電活動異常，進而出現心肌肥厚、心律失常，最終發生心力衰竭等臨床病癥[1～3]。因此，早期阻抑由高血糖引起的心肌損傷進程對于DCM患者的預后至關重要。丹參素是活血化瘀類中藥丹參的主要水溶性成分之一，其通過抗氧化、抗炎、抗凋亡、降低鈣離子超載等途徑保護心肌細胞[4～7]。然而，丹參素在高糖條件下能否發揮心肌保護作用尚不確定。2015年10月～2016年6月，本研究在體外建立高糖誘導的心肌細胞損傷模型，觀察丹參素對高糖條件下心肌細胞的保護效應及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 H9C2大鼠心肌細胞(美國ATCC細胞庫)，丹參素(中國食品藥品檢定研究院)，FBS(美國Hyclone公司)，DMEM細胞培養基(美國Gibco公司)，0.25%胰酶消化溶液(以色列Biological Industries公司)，葡萄糖(美國Amresco公司)，CCK-8細胞活力檢測試劑盒(日本同仁公司)，乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)生化檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，IL-6、IL-1β、TNF-α、單核細胞趨化因子1(MCP1)、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)ELISA檢測試劑盒(武漢優爾生商貿有限公司)，細胞總RNA提取試劑盒(美國OMEGA公司)，RNA反轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒以及Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、GAPDH基因驗證型引物(廣州復能基因公司)。細胞觀察倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、 CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)、酶標儀(美國Thermo Scientific Multiskan公司)、實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 細胞培養及分組 將H9C2細胞用含10% FBS的低糖(5 mmol/L)DMEM培養基以2×107/L接種于T25培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。2～3 d后待細胞密度近90%時用0.25%胰酶溶液消化后傳代培養。取指數生長期的H9C2細胞隨機分為6組:A組：使用10%FBS低糖(5 mmol/L葡萄糖)DMEM培養基；B組：使用含10% FBS及高糖(30 mmol/L葡萄糖)DMEM培養基；C組：在高糖組培養液基礎上加2 mg/L丹參素；D組：在高糖組培養液基礎上加4 mg/L丹參素；E組：在高糖組培養液基礎上加8 mg/L丹參素；F組：在高糖組培養液基礎上加16 mg/L丹參素。

1.3 細胞活力檢測 采用CCK法。取指數生長期H9C2細胞，用10%FBS低糖DMEM培養基將細胞制成1×105/mL的細胞懸液，按每孔100 μL細胞懸液加入至96孔細胞培養板，放置于細胞培養箱中培養1 d后棄去細胞培養液，每組設置6個復孔分別加入100 μL相應的細胞培養液干預18 h后每孔中加入10 μL CCK-8溶液繼續孵育2 h，孵育結束后在酶標儀450 nm波長下測定吸光度值(A450)。

1.4 細胞培養液中氧化應激及炎癥因子檢測 取指數生長期H9C2細胞，用10% FBS低糖DMEM培養基將細胞制成1×105/mL的細胞懸液，按每孔500 μL細胞懸液加入至24孔細胞培養板，放置于細胞培養箱中培養1 d后棄去細胞培養液，每組設置6個復孔分別加入500 μL相應的細胞培養液干預18 h后收集細胞培養液于EP管中，將細胞培養液以12 000 r/min離心5 min后取上清液。按照生化檢測試劑盒操作要求檢測上清液中LDH、CK、MDA、SOD、GSH-Px含量。按照ELISA檢測試劑盒操作要求檢測上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量。

1.5 H9C2細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2 mRNA相對表達的檢測 采用實時熒光定量PCR法。取指數生長期H9C2細胞，用10% FBS低糖DMEM培養基將細胞制成1×105/mL的細胞懸液，按每孔2 mL細胞懸液加入至6孔細胞培養板，放置于細胞培養箱中培養1 d后棄去細胞培養液，每組設置3個復孔分別加入2 mL相應的細胞培養液干預18 h后收集H9C2細胞，按照各試劑盒要求提取細胞總RNA，反轉錄后將cDNA及待測基因引物加入擴增反應體系中進行實時熒光定量PCR檢測。ΔCt值=樣本基因平均Ct值-相應內參基因平均Ct值；ΔΔCt值=每組ΔCt值-對照組ΔCt值；每組待測目的基因的相對表達倍數值=2-ΔΔCT，根據得出的該相對表達倍數值進行統計分析。

2 結果

2.1 各組H9C2細胞活力比較 與A組比較，B組A450值明顯下降(P<0.05)；與B組比較，C、D、E、F組A450值升高(P均<0.05)，以E組為最高。見圖1。

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

圖1 6組H9C2細胞活力比較

2.2 各組細胞培養液LDH、CK、MDA、SOD、GSH-Px含量比較 與A組比較，B組細胞培養液中LDH、CK、MDA含量增加，SOD、GSH-Px含量降低(P均<0.05)；與B組比較，C、D、E、F組細胞培養液中LDH、CK、MDA含量低，SOD、GSH-Px含量高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞培養液LDH、CK、MDA、SOD、GSH-Px含量比較

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

2.3 各組細胞培養液IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量比較 與A組比較，B組細胞培養液中IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量高(P均<0.05)；與B組比較，C、D、E、F組細胞培養液中IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量低(P均<0.05)。見表2。

2.4 各組H9C2細胞凋亡因子mRNA相對表達比較 與對照組比較，B組H9C2細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA相對表達水平上升，Bcl-2 mRNA相對表達水平下降(P均<0.05)；與B組比較，C、D、E、F組H9C2細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達水平不同程度地降低，Bcl-2 mRNA表達水平不同程度升高(P均<0.05)。見表3。

表2 各組H9C2細胞培養液IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量比較

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

表3 各組H9C2細胞凋亡因子mRNA相對表達比較

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

3 討論

DCM的病理過程是細胞氧化應激、細胞凋亡壞死、炎癥反應等諸多機制交互作用的復雜病理狀態[3]。持續高糖狀態刺激心肌細胞產生過度的氧化應激反應進而出現應激損傷，大量活性氧物質(ROS)的生成進一步激活線粒體依賴的細胞凋亡途徑；與此同時大量糖化終產物(AGEs)堆積促使心肌細胞炎性因子表達，進而募集炎癥細胞進一步導致心肌組織損傷壞死，最終致使心肌結構各功能的破壞和失常。本研究發現，高糖條件培養的H9C2大鼠心肌細胞活力明顯下降，細胞上清液LDH與CK水平明顯升高，表明H9C2細胞在高糖條件下出現了細胞膜的破壞；MDA水平明顯升高，SOD、GSH-Px水平明顯降低，表明H9C2細胞在高糖條件下抗氧化能力降低，清除ROS的能力減弱，進而出現了脂質過氧化物導致細胞毒作用。H9C2細胞在高糖條件下炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF大量表達，表明心肌細胞在高糖狀態下出現了早期的炎癥狀態，這種瀑布式的炎癥級聯反應會進一步募集炎癥細胞進入心肌組織加重心肌壞死。高糖條件下H9C2細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達水平升高，Bcl-2 mRNA表達水平下降，說明Caspase信號級聯瀑布的關鍵調控節點被激活及線粒體膜破壞，出現了線粒體依賴的細胞凋亡。該凋亡途徑一方面由ROS大量生成和AGEs堆積介導產生，另一方面也與炎性因子的刺激有關。本研究結果提示,不同濃度的丹參素在高糖誘導的心肌細胞氧化應激損傷、炎癥反應以及細胞凋亡等狀態激活方面的指標表達均具有一定的反轉作用，說明丹參素通過如上幾條途徑對高糖條件下的心肌細胞發揮了保護性作用。糖尿病合并癥常涉及到視網膜病變、腎臟病變、神經病變、心肌病變等諸多系統組織器官病變，涉及范圍十分廣泛遍及周身。糖尿病患者一旦出現并發癥僅僅通過調節血糖水平并不能完全阻抑受累組織器官的病變進程。DCM患者的治療同樣在調控血糖的基礎治療之上應當重視心肌細胞的保護。本研究為DCM患者心肌保護的藥物治療策略提供了一定的參考。

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天津市衛生局課題(07025)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.015

R363

A

1002-266X(2016)45-0048-03

2016-10-10)