膀胱尿路上皮癌組織中ING4、p53、Ki-67蛋白的表達(dá)變化及意義

張萌，伍季，夏中友，李云祥，范俊

(1川北醫(yī)學(xué)院，四川南充63700；2 南充市中心醫(yī)院)

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·臨床研究·

膀胱尿路上皮癌組織中ING4、p53、Ki-67蛋白的表達(dá)變化及意義

張萌1，伍季2，夏中友2，李云祥2，范俊2

(1川北醫(yī)學(xué)院，四川南充63700；2 南充市中心醫(yī)院)

目的 探討膀胱尿路上皮癌組織中生長(zhǎng)抑制因子4(ING4)、p53、Ki-67蛋白的表達(dá)變化及意義。方法 采用免疫組化法分別檢測(cè)60例份膀胱尿路上皮癌組織、60例份癌旁組織、37例份膀胱正常黏膜組織中ING4、p53、Ki-67蛋白的表達(dá)，并分析其與膀胱癌患者病理分級(jí)、臨床分期及臨床資料的關(guān)系。Spearman 等級(jí)相關(guān)分析癌組織中三者的相關(guān)性。結(jié)果 膀胱尿路上皮癌組織、癌旁組織及膀胱正常黏膜組織ING4蛋白的陽性表達(dá)率分別為70.0%(42/60)、100%(60/60)、97.2%(36/37)，p53的陽性表達(dá)率分別為96.7%(58/60)、13.3%(8/60)、13.5%(5/37)，Ki-67蛋白的陽性表達(dá)率分別為91.7%(55/60)、11.7%(7/60)、2.7%(1/37)，與膀胱尿路上皮癌組織比較，膀胱正常黏膜組織和癌旁組織中ING4蛋白陽性表達(dá)率高，p53、Ki-67蛋白陽性表達(dá)率低(P均<0.05)。ING4蛋白在膀胱尿路上皮癌的表達(dá)與病理分級(jí)及臨床分期有關(guān)(P均<0.05)；p53和Ki-67蛋白表達(dá)與病理分級(jí)、臨床分期及腫瘤的發(fā)病個(gè)數(shù)有關(guān)(P均<0.05)。 ING4與p53、Ki-67蛋白呈負(fù)相關(guān)(rs分別為-0.301、-0.315，P均<0.05)；p53與Ki-67蛋白呈正相關(guān)(rs=0.625，P<0.05)。結(jié)論 膀胱尿路上皮癌組織中ING4蛋白水平降低，p53和Ki-67蛋白水平升高，其均參與癌的發(fā)生、發(fā)展。

膀胱尿路上皮腫瘤；生長(zhǎng)抑制因子4；p53；Ki-67蛋白

膀胱癌在全世界屬于第五大常見惡性腫瘤，約占全部惡性腫瘤的3.2%，在我國(guó)其發(fā)病率位居泌尿系腫瘤首位，男性患病率是女性患病率的3～4倍，發(fā)病年齡主要處于50～70歲[1]。75%～85%的膀胱尿路上皮癌屬于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，其他為肌層浸潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移性癌[2]。尿路上皮癌從形態(tài)上和遺傳學(xué)上是多樣化的腫瘤，擁有不同的癌細(xì)胞系和特定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變[3]。近年雖然許多腫瘤標(biāo)記物相繼用于膀胱癌的預(yù)后判斷, 但迄今為止尚無可供臨床常規(guī)使用的腫瘤標(biāo)記物。為尋找新的腫瘤標(biāo)記物，本研究觀察了ING4、p53、Ki-67在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)變化，并探討了其與臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和南充市中心醫(yī)院2014～2015年經(jīng)手術(shù)切除的并有完整臨床資料的膀胱尿路上皮癌組織60 例份, 其中患者男43例、女17例, 年齡45～80歲、平均61歲，年齡﹥60歲31例、≤60歲29例。癌旁組織60例份，均取自患者距離癌組織邊緣約2 cm以上的正常膀胱黏膜組織。病理分級(jí)按世界衛(wèi)生組織2004年標(biāo)準(zhǔn)確定, 低級(jí)別29例、高級(jí)別31例。臨床病理分期按國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)確定,非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(Tis～T1)28例、肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(T2～T4)32例。膀胱正常黏膜組織37例份是通過膀胱切開取石及開放前列腺切除術(shù)所收集。患者男23例、女7例。

1.2 組織ING4、p53、Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組化SP法。鼠抗人p53 IgG單克隆抗體、鼠抗人Ki-67核抗原、免疫組織化學(xué)染色SP試劑、DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物制品有限公司,鼠抗人ING4多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，按試劑盒說明書操作。以扁桃體腺體切片作Ki-67的陽性對(duì)照；以直腸癌切片作p53的陽性對(duì)照；以睪丸切片作ING4的陽性對(duì)照；用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗,作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 由2位病理科主任醫(yī)師在臨床和病理資料不知曉的情況下獨(dú)立觀察切片,并進(jìn)行染色評(píng)分。使用半定量的評(píng)分系統(tǒng)來評(píng)估抗體的染色效果，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野或500個(gè)細(xì)胞。ING4陽性表達(dá)為細(xì)胞核和(或)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒；p53 陽性表達(dá)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒；Ki-67陽性表達(dá)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。按染色強(qiáng)度計(jì)分:0 分為無色，1分為淡黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色；按陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：0 分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2 分為陽性細(xì)胞數(shù)11%～50%，3分為陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%，4分為陽性細(xì)胞數(shù)>75%；染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞所占百分比乘積得染色系數(shù)：0～2為-，≥3為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。等級(jí)資料的兩樣本比較采用秩和檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ING4、p53、Ki-67蛋白在膀胱尿路上皮癌、癌旁和膀胱正常黏膜組織中的相對(duì)表達(dá) 膀胱尿路上皮癌、癌旁和膀胱正常黏膜組織中，ING4蛋白的陽性表達(dá)率分別為70.0%(42/60)、100%(60/60)、97.2%(36/37)，p53蛋白的陽性表達(dá)率分別為96.7%(58/60)、13.3%(8/60)、13.5%(5/37)，Ki-67蛋白的陽性表達(dá)率分別為91.7%(55/60)、11.7%(7/60)、 2.7%(1/37)，與膀胱尿路上皮癌組織比較，膀胱正常黏膜組織和癌旁組織中ING4蛋白陽性表達(dá)率高，p53、Ki-67蛋白陽性表達(dá)率低(P均<0.05)。在膀胱正常黏膜組織與癌旁組織中，ING4、p53、Ki-67蛋白陽性表達(dá)率比較，P均>0.05。

2.2 ING4、p53、Ki-67蛋白表達(dá)與膀胱尿路上皮癌患者臨床病理特征的關(guān)系 ING4蛋白在膀胱尿路上皮癌的表達(dá)與患者的性別、年齡、初發(fā)、復(fù)發(fā)以及腫瘤的大小、位置、個(gè)數(shù)無相關(guān)性(P均>0.05)，與病理分級(jí)及臨床分期有關(guān)(P均<0.05)；p53和Ki-67蛋白與病理分級(jí)、臨床分期及腫瘤的發(fā)病個(gè)數(shù)有關(guān)(P均<0.05)，與患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、初發(fā)或復(fù)發(fā)均無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

2.3 膀胱尿路上皮癌組織中ING4、p53、Ki-67蛋白三者之間的相關(guān)性 ING4與p53、Ki-67蛋白呈負(fù)相關(guān)(rs分別為-0.301、-0.315，P均<0.05)；p53與Ki-67蛋白呈正相關(guān)(rs=0.625，P<0.05)。

3 討論

ING4基因是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤抑制基因，為第2類腫瘤生長(zhǎng)抑制因子家族的一員，由Shiseki等[4]在2003年發(fā)現(xiàn)并從人腦垂體中被分離出來。該基因定位于染色體12p13-31區(qū)域內(nèi)，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，基因跨距13 kb。ING4基因編碼蛋白包括一個(gè)具有高度保守的植物同源結(jié)構(gòu)域和一個(gè)核定位信號(hào)(NLS)區(qū)[5]。文獻(xiàn)報(bào)道，ING4基因在許多腫瘤中如膠質(zhì)瘤、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、頭頸部的鱗狀上皮細(xì)胞癌、惡性黑色素瘤、肝細(xì)胞癌等中起抑制作用。隨著對(duì)ING4研究的進(jìn)一步深入，人們發(fā)現(xiàn)ING4具有的功能包括增強(qiáng)p53活性，維持細(xì)胞間的接觸性抑制，抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、低氧誘導(dǎo)因子的活性，參與組蛋白乙酰化，抑制腫瘤生長(zhǎng)、新生血管形成，影響細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬，增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性[6,7]。但是有關(guān)ING4基因在膀胱癌組織中研究的文獻(xiàn)不多。本試驗(yàn)結(jié)果提示，ING4基因在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)量下降，并隨著腫瘤病理級(jí)別或臨床分期的升高其表達(dá)水平下降，而ING4蛋白在正常組織、癌旁組織的陽性表達(dá)率明顯高于癌組織，這說明ING4蛋白表達(dá)水平的下降與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，也提示ING4蛋白在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起抑制作用。

表1 ING4、p53、Ki-67蛋白表達(dá)與膀胱尿路上皮癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

p53作為抑癌基因在抑制腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。p53通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因如p21、MDM2、CD95/fas、Bax、WT1、p53AIP1、PAG608、HER2、PCNA、cyclin G等從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、DNA損傷、血管生成和轉(zhuǎn)移的抑制及其他功能[8]。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)在不同惡性腫瘤中，p53與高級(jí)的病理分級(jí)、臨床分期、不良預(yù)后、復(fù)發(fā)、病死率均存在一定的相關(guān)性[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤臨床分期、病理分級(jí)越高以及腫瘤個(gè)數(shù)的增多，p53蛋白陽性表達(dá)率越高。ING4基因能夠通過增強(qiáng)p53的作用從而起到激活細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期的作用，其機(jī)制可能是ING4蛋白的NLS轉(zhuǎn)錄的氨基酸蛋白能參與p53活化后的四聚化、細(xì)胞內(nèi)定位及調(diào)節(jié)p53蛋白轉(zhuǎn)錄，同時(shí)ING4的NLS區(qū)域能與p53結(jié)合，進(jìn)而增強(qiáng)p53蛋白活性和提高p53的甲基化。

Ki-67是一種增殖相關(guān)性核抗原,在細(xì)胞周期中的G1、S、G2和M期中均有合成，其可準(zhǔn)確反映細(xì)胞增殖狀況。一些研究報(bào)告提示，Ki-67的增殖系數(shù)能夠作為單獨(dú)因素來評(píng)估腫瘤的病理分級(jí)、臨床分期、預(yù)后、復(fù)發(fā)等，并且Ki-67在腫瘤中的過表達(dá)與腫瘤的侵襲性存在密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，Ki-67蛋白隨著腫瘤臨床分期、病理分級(jí)越高以及腫瘤個(gè)數(shù)的增多，Ki-67蛋白陽性表達(dá)率增高。Nanding等[10]在胃腸道間質(zhì)瘤發(fā)現(xiàn)，ING4蛋白隨著腫瘤的分級(jí)升高，其表達(dá)呈下降趨勢(shì)，并與Ki-67蛋白呈負(fù)相關(guān)，其結(jié)果顯示兩者與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有負(fù)相關(guān)性。本試驗(yàn)中也觀察到ING4和Ki-67蛋白與腫瘤的病理分級(jí)或臨床分期有關(guān)，這表明ING4及Ki-67蛋白與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲性有關(guān)，但I(xiàn)NG4與Ki-67蛋白之間的具體作用機(jī)制仍不清楚。

任何單一腫瘤標(biāo)記物都不能全面準(zhǔn)確地反映腫瘤的惡性潛能，更無法完全預(yù)測(cè)其預(yù)后。膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多基因影響的復(fù)雜過程，聯(lián)合檢測(cè)ING4、p53及Ki-67可能對(duì)膀胱癌的早期診斷、精準(zhǔn)治療及預(yù)測(cè)預(yù)后提供一定的幫助。本試驗(yàn)結(jié)果顯示隨著腫瘤的病理分級(jí)或臨床分期升高，ING4與p53、Ki-67蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，提示ING4基因在抑制膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，并且聯(lián)合檢測(cè)膀胱尿路上皮癌中ING4、p53及Ki-67蛋白表達(dá)有一定的臨床意義,這不但有利于揭示膀胱癌發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的機(jī)制, 也能作為評(píng)價(jià)患者預(yù)后的參考指標(biāo)。

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四川省教育廳科研項(xiàng)目(13EA0226)。

伍季(E-mail：wuji2168@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.017

R737.14

B

1002-266X(2016)45-0054-03

2016-08-12)