草莓莖尖快速繁殖體系的研究

張春芬，潘天任，鄧舒，肖蓉，聶元軍，李倩，蘇東濤，曹秋芬，，孟玉平

（1.山西省農業科學院果樹研究所，山西太原030031；2.山西省農業科學院，山西太原030031；3.山西省農業科學院農業資源與經濟研究所，山西太原030006；4.山西大學生物工程學院，山西太原030006；5.山西省農業科學院生物技術研究中心，山西太原030031）

草莓莖尖快速繁殖體系的研究

張春芬1，潘天任2，鄧舒1，肖蓉1，聶元軍3，李倩4，蘇東濤3，曹秋芬1，5，孟玉平5

（1.山西省農業科學院果樹研究所，山西太原030031；2.山西省農業科學院，山西太原030031；3.山西省農業科學院農業資源與經濟研究所，山西太原030006；4.山西大學生物工程學院，山西太原030006；5.山西省農業科學院生物技術研究中心，山西太原030031）

以“紅顏”草莓匍匐莖莖尖為外植體，研究了不同次氯酸鈉質量分數及處理時間、不同濃度激素配比對莖尖增殖、組培苗生根的影響，以篩選出外植體最適的消毒處理和最適合的培養基。結果表明，草莓“紅顏”匍匐莖莖尖消毒以2%次氯酸鈉處理10～15 min為宜；不定芽增殖以1.0 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IBA組合與0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/LIBA較佳；適宜生根的培養基為1/2 MS＋0.1～0.3 mg/LIBA。

草莓；莖尖；快速繁殖

草莓（Fragaia ananassa Duchesne）屬薔薇科草莓屬多年生常綠草本植物，是世界上廣泛栽培的重要經濟作物。其色澤鮮艷，多汁，酸甜可口，芳香宜人，有“水果皇后”之美譽[1]。加之適應性廣，栽培容易，生產周期短，見效快，經濟效益高，特別是溫室保護地栽培技術的快速發展，可以使之提前或延遲上市，實現周年生產和供應，加速了草莓生產面積的迅速擴大[2]。為確保生產出高品質的草莓果實，必需提供大量的優質草莓種苗。傳統生產過程中，草莓主要通過匍匐莖分株繁殖提供種苗，而匍匐莖分株繁殖苗繁殖系數低，苗質量差，且易感染病毒，影響種苗的品質及其經濟價值，成為阻礙草莓生產的主要問題[3]。通過組織培養快速繁殖技術獲得大量脫毒苗是解決這一問題的有效途徑[4]。

本研究利用草莓“紅顏”莖尖作為外植體，通過研究外植體的消毒時間、不同激素配比對草莓莖尖增殖及生根的影響，篩選出有利于草莓組培繁殖的最佳處理，以建立簡易高效的草莓快繁技術體系，為實現脫毒苗工廠化、規模化生產，快速培育優良的草莓種苗提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料

以草莓栽培品種“紅顏”的匍匐莖莖尖為試驗材料，采自陽曲縣浦豐農林科技有限公司試驗基地。

1.2 方法

試驗在山西省農業科學院生物技術研究中心研究室進行。

1.2.1 外植體消毒連續晴天的下午，自田間選取健壯母株上生長充實、頂端懸空而小葉未展開的匍匐莖，帶回實驗室，剪取頂端約5 cm長的頂芽，用紗布包好置于自來水下沖洗1 h，在超凈工作臺內用75%酒精浸泡30 s后，用滅菌蒸餾水沖洗2～3遍，轉入2%～5%次氯酸鈉中，不斷搖動燒杯，使次氯酸鈉溶液與莖尖充分接觸，經不同時間消毒后，再用無菌水沖洗4～5遍，用無菌吸水紙吸干表面水分，在解剖鏡下切取約2 mm的莖尖生長點，接種于初代培養基上。

試驗設次氯酸鈉質量分數為2%，5%共2個水平，消毒時間為5，10，15 min共3個水平，總共6個處理。每瓶接種一個莖尖，每個處理接種20瓶，重復3次。污染率、褐化率在接種后10 d統計，萌發率在接種30 d后進行統計。

污染率＝污染芽數/接種芽數×100%；褐化率＝褐化芽數/接種芽數×100%；萌發率＝萌發芽數/接種芽數×100%。

1.2.2 繼代增殖初代接種成活21～28 d后，將萌發芽轉入增殖培養基中，增殖培養基為添加不同濃度的6-BA與IBA的MS培養基。

試驗設細胞分裂素6-BA質量濃度為0，0.3，0.5，0.8，1.0 mg/L共5個水平，生長素IBA質量濃度為0，0.1，0.3，0.5 mg/L共4個水平，共為14個組合。每瓶接3株，每處理10瓶，重復3次，30 d后調查增殖情況。增殖系數＝總增殖芽個數/總接種芽個數。

1.2.3 生根培養待繼代植株長到一定大小時，自健壯苗上切取具三葉一心的不定芽接種于生根培養基上，生根培養基為1/2MS添加不同濃度的IBA。

試驗設置生長素IBA質量濃度為0，0.1，0.3，0.5 mg/L共4個處理。每瓶接3株，每處理10瓶，重復3次，25 d后調查生根情況。平均生根條數＝總不定根數/生根芽數。

1.2.4 煉苗與移栽生根培養21～28 d后植株長出3～5條1～3 cm的不定根后，將培養瓶移至溫室煉苗，溫度為25℃左右，2～3 d后瓶內小苗葉色深綠、表面有蠟質層出現時打開瓶蓋，繼續煉苗3～5 d后從瓶內取出植株，洗去根部附著的培養基，然后浸入50%多菌靈可濕性粉劑500倍液5～10 min，沖洗晾干后定植于蛭石作基質的營養缽內并澆透水，保濕培養7 d觀察其存活情況。

1.2.5 培養條件培養基如無特別說明，均添加3%蔗糖、6.5 g/L瓊脂，pH值為5.8，培養基121℃滅菌20 min，自然冷卻后備用。培養條件為：溫度（25±2）℃，14 h光照，光照強度3 000 lx。

2 結果與分析

2.1 不同處理時間對“紅顏”匍匐莖莖尖消毒效果的影響

由表1可知，次氯酸鈉質量分數為2%和5%時，污染率隨著處理時間的增加而降低，而褐化率與之相反，隨著處理時間的增加而升高；污染率在2%次氯酸鈉處理5 min時最高，達71.7%，在5%次氯酸鈉處理15 min時最低，降至23.3%，褐化率則在2%次氯酸鈉處理5 min時最低，為3.3%，在5%次氯酸鈉處理15 min時最高，達到48.3%。Duncan方差分析顯示，污染率在2%次氯酸鈉處理5 min與其他5個處理間存在顯著差異，2%次氯酸鈉處理10，15 min和5%次氯酸鈉處理10，15 min間不存在顯著差異，5%次氯酸鈉處理5 min與處理10，15 min間都存在顯著差異。褐化率在2%次氯酸鈉處理5，10 min之間不存在差異，與其他4個處理間差異顯著，5%次氯酸鈉處理10，15 min的褐化率與其他4個處理間都存在顯著差異。接種30 d后的萌發率表現為在2%次氯酸鈉處理10 min時最高，為48.3%，其次為2%次氯酸鈉處理15 min時的46.7%，這二者之間不存在差異，但都與2%次氯酸鈉處理5 min（25.0%）和5%次氯酸鈉處理15 min（28.3%）存在顯著差異。綜合污染率、褐化率及萌發率，草莓“紅顏”匍匐莖莖尖消毒以2%次氯酸鈉處理10～15 min為適宜時間。

表1 不同處理時間對“紅顏”匍匐莖莖尖消毒效果的影響

2.2 外源激素對“紅顏”繼代增殖的影響

將長勢一致的無菌苗分組接種到添加不同質量濃度的6-BA與IBA的增殖培養基中，培養30 d后統計各激素組合的不定芽增殖情況。從表2可以看出，草莓在無添加激素的培養基上也能增殖，但是增殖系數小，不能滿足試驗及工廠化生產的需要。在添加1.0 mg/L 6-BA和0.3 mg/L IBA的培養基上，“紅顏”草莓的增殖系數最大，但苗生長過快，容易形成畸形苗，且玻璃化嚴重；其次依次為組合1.0 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IBA，0.8 mg/L 6-BA＋0.3 mg/LIBA，0.8 mg/L6-BA＋0.1 mg/LIBA，增殖系數分別為8.54，8.39，8.08，各組合間不存在顯著差異，但是只在添加0.8 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IBA的培養基上植株長勢健壯，其他組合則多畸形苗，容易玻璃化。在設定的各激素組合中，以0.8mg/L6-BA＋0.3 mg/L IBA組合與0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IBA組合較佳，苗生長健壯，增殖系數分別為8.39和7.74，二者之間不存在差異。

表2 外源激素對“紅顏”繼代增殖的影響

2.3 IBA質量濃度對“紅顏”組培苗生根的影響

由表3可知，“紅顏”草莓的組織培養無菌苗極易生根，在不添加任何激素的1/2 MS中也能生根，但平均生根僅有2.1條，根系較短，且纖細。添加一定質量濃度的IBA能促進不定根的形成，在添加0.5 mg/L IBA培養基中雖平均生根條數最多（6.8），與其他處理都存在顯著差異，但有愈傷組織形成，且根系纖細，移栽不易成活。在添加0.1，0.3 mg/L IBA時根系較長，且粗壯，有利于再生苗移栽成活。

表3 不同培養基對草莓生根的影響

3 討論與結論

在植物的離體培養中，無菌外植體的獲得是試驗研究順利進行的關鍵步驟[5]。從自然界采集的植物器官和組織材料表面攜帶有各種微生物，因此，在接種前，對植物材料進行表面消毒是植物組織培養的首要工作。目前，有多種化學試劑作為消毒劑可用于植物組織培養外植體消毒，如2%～5%次氯酸鈉、0.1%升汞、10%過氧化氫等，這些試劑都對植物組織的表面消毒有良好的效果[6-7]。升汞是草莓常用的外植體表面消毒劑，但由于其是有劇毒的重金屬鹽消毒劑，殘留大，對環境和外植體材料都有很大毒害，因此，本研究選用無毒害作用且殘留少的次氯酸鈉作為消毒劑，次氯酸鈉濃度大小與處理時間的長短不僅影響外植體的消毒效果，還影響著外植體的萌芽率。本研究中，草莓最佳處理為2%次氯酸鈉處理10～15 min，處理時間過短會增加污染率，增大工作量；而次氯酸鈉濃度過高雖能降低污染率但容易使外植體褐化，影響生長甚至導致死亡。

外源激素是植物組織培養基中不可缺少的關鍵物質，其濃度和比例會影響器官的分化，對植物離體器官的生長和分化起到非常重要的作用。草莓組培苗的增殖擴繁過程中，適當濃度的激素組合是獲得高質量、高增殖系數一個關鍵因素，激素濃度過高或過低都會影響不定芽的增殖及生長效果。饒雪梅[8]研究了IBA質量濃度對草莓組培增殖的影響，結果表明，增殖系數隨IBA質量濃度增大而變大，但是在較高質量濃度時，玻璃化比較嚴重。本研究也證實，較高質量濃度IBA不利于不定芽的增殖，反而增加了愈傷組織的分化。本研究結果表明，IBA質量濃度低于0.5 mg/L時，增殖系數隨6-BA質量濃度的提高而增大，但是6-BA質量濃度達到1.0mg/L時，不定芽畸形或玻璃化嚴重，這與袁倩等[9]的研究結論一致，使用較高質量濃度的6-BA進行草莓增殖培養增殖系數增大，但是易出現玻璃化[10]。本研究還發現，在6-BA質量濃度為0.8 mg/L時與0.3 mg/L IBA組合優于其他3個組合，但是與0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IBA組合之間不存在顯著差異，說明在草莓培養中改變其中一個激素的質量濃度時，適當改變另一激素的質量濃度同樣能達到相同的效果。由此可見，在一定的質量濃度范圍內，激素比例是影響草莓增殖分化的重要因素。

組培苗不定根的再生直接影響植物組培快繁工作的成本、工作效率和經濟效益。與植物莖尖及其他幼嫩組織相比，根系對激素濃度的變化相對比較敏感，因此，誘導生根所需的激素水平較低。草莓生根常用激素有IAA，IBA，NAA。本試驗發現，不添加激素時也能誘導不定芽生根，但是根系纖細，且發根量少，添加一定濃度的IBA促進了不定根的形成，濃度增加到0.5 mg/L時，反而會增加愈傷組織的形成，造成根系纖細，不利于移栽成活。崔廣榮等[11]試驗發現，沒有添加任何激素的對照效果最好，這可能是由于內源激素已能滿足植株生根的需要或IBA不利于此基因型草莓誘導生根，因此，在進行草莓生根培養時，要根據試驗情況，慎重選擇。此外，不少研究者發現，不同品種間對激素的濃度需求存在一定的差異，薛其勤等[12]在對豐香、章姬、甜查理、紅顏、卡姆羅莎5個品種的試驗中發現，與其他品種相比，豐香極易生根，在增殖培養基中也會有少量根系產生。

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Study on Rapid Propagation ofFragaia ananassaDuchesne Stem Tip

ZHANGChun-fen1，PANTian-ren2，DENGShu1，XIAORong1，NIE Yuan-jun3，LI Qian4，SUDong-tao3，CAOQiu-fen1，5，MENGYu-ping5
（1.Institute ofPomology，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；2.Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.Institute ofAgricultural Resources and Economy，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030006，China；4.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；5.Research Center ofBiotechnology，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

To select the most suitable sterilization time and the most suitable medium,the effects of different disinfection time, different hormone combinations were studied in tissue culttre ofstrawberrytakingthe stemtip as explant material.The results showed that the best sterilization time by 2%NaClO was 10-15 min,the best generation media was 1.0 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IBA or 0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/LIBA.The most suitable rootingmediumwas 1/2 MS＋0.1-0.3 mg/LIBA.

strawberry;stemtip;rapid propagation

S668.4

A

1002-2481（2016）03-0291-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.04

2015-10-09

山西省農業科學院科技自主創新能力提升工程項目（2015zzcx-22）；山西省農業科學院果樹研究所項目

張春芬（1981-），女，山西翼城人，助理研究員，博士，主要從事園藝植物生物技術研究工作。