響應面法優化山茱萸葉葉綠素的超聲提取工藝

史淑紅，郝建平，王秋寶，趙玉臣，楊文飛

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西省藥物培植場，山西絳縣043610）

響應面法優化山茱萸葉葉綠素的超聲提取工藝

史淑紅1，郝建平1，王秋寶1，趙玉臣2，楊文飛1

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西省藥物培植場，山西絳縣043610）

以山茱萸葉為研究對象，在單因素試驗的基礎上設計中心組合試驗，對液料比、超聲提取時間、乙醇/丙酮混合溶劑中乙醇體積分數和提取溫度進行條件優化。結果表明，用超聲波輔助提取山茱萸葉葉綠素的最優條件是：液料比165.23∶1（mL/g），超聲提取時間40.66 min，乙醇/丙酮混合溶劑中乙醇體積分數30.81%，提取溫度50.71℃。在此條件下，葉綠素提取率可達0.593%。

山茱萸葉；葉綠素提取；中心組合設計；響應面法

山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc）在我國栽培歷史悠久[1]，其味酸、澀，微溫，具有滋補肝腎、澀精固脫之功效[2]，并有增強免疫力、降低血糖等藥理作用[3]，是我國傳統常用的中藥材[4-5]。近年來，山茱萸也應用于園林綠化中，其花、葉、果具有獨特的觀賞價值[6]。目前，國內外對山茱萸研究主要集中于藥理藥化方面[7]，尚未見對葉片中葉綠素進行提取、利用的報道。

綠色植物中的葉綠素含量是光合作用和氮素營養狀況的評價指標之一，葉綠素的測定對于樹種分布、病理研究以及科學育種等具有一定的參考意義。葉綠素無毒，可食用，具有抗氧化和抗突變特性，廣泛應用于食品、化妝品、醫藥等領域。超聲波技術是通過超聲波在溶劑中產生的振動、攪拌和空化作用使組織細胞破裂，使其有效成分溶出[8-9]，目前已用于多種樹木葉綠素的提取。

為了更好地開發和利用山茱萸資源，本研究采用中心組合設計優化山茱萸葉中葉綠素的提取工藝，旨在為今后山茱萸的育種、栽培和綜合利用提供借鑒和指導，為園林植物造景提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試山茱萸葉在山西藥物培植場采集。

1.2 儀器及試劑

BS124S電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；KQ-100E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-2000紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司；HC-2518高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司。乙醇、丙酮為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 葉綠素提取方法山茱萸葉→烘干（50℃）→粉碎（0.25 mm）→超聲波提取→離心15 min（1 000 r/min）→取上清液。采用超聲波提取葉綠素，在提取過程中采用避光處理[10-12]，應用紫外分光光度計分別測定645，663 nm處的吸光度值[13]。參照魏文愷等[14]利用超聲波提取葛葉中葉綠素提取率的計算公式進行計算。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 液料比對葉綠素提取效果的影響稱取0.1 g的山茱萸葉粉末，分別加入乙醇體積分數為50%的乙醇/丙酮溶液2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 mL，在30℃下提取20 min，確定最適的液料比。

1.3.2.2 超聲提取時間對葉綠素提取效果的影響稱取0.1 g山茱萸葉粉末，加入50%的乙醇/丙酮溶液16mL，在30℃下分別提取10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110 min，確定最適的超聲提取時間。

1.3.2.3 乙醇體積分數對葉綠素提取效果的影響

稱取0.1 g山茱萸葉粉末，加入乙醇體積分數分別為0，10%，20%，30%，40%，50%，70%，90%，100%的乙醇/丙酮溶液16 mL，在30℃下提取40 min，確定最適的乙醇體積分數。

1.3.2.4 提取溫度對葉綠素提取效果的影響稱取0.1 g山茱萸葉粉末，加入30%的乙醇/丙酮溶液16 mL，分別在15，25，35，45，55，65，75℃下提取40 min，確定最適的提取溫度。

1.3.3 響應面試驗結合單因素試驗結果，對液料比（A）、提取時間（B）、乙醇體積分數（C）和提取溫度（D）4個因素進行中心組合設計（central composite design，CCD），利用Design-Expert 6.0.5軟件進行數據擬合，以±2，±1，0代表自變量水平，試驗設計列于表1。

表1 響應面分析因素水平的設計

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對葉綠素提取效果的影響從圖1可以看出，選用160 mL/g作為最優值，且在140～180 mL/g做進一步優化。

2.1.2 超聲提取時間對葉綠素提取效果的影響

從圖2可以看出，提取時間40min為最優值，同時在30～50 min做進一步優化。

2.1.3 乙醇休積分數對葉綠素提取效果的影響由圖3可知，30%的體積分數為混合溶劑的最佳值，并且在20%～40%做進一步優化。

2.1.4 提取溫度對葉綠素提取效果的影響由圖4可知，葉綠素提取溫度以45，55℃較佳，其中間值50℃可能是最優，所以，在40～60℃做進一步優化。

2.2 響應面法提取條件優化

2.2.1 響應面試驗結果響應面試驗以液料比（A）、提取時間（B）、乙醇體積分數（C）、提取溫度（D）為自變量，Y（葉綠素提取率）為響應值，結果列于表2。

使用Design-Expert 6.0.5軟件進行非線性回歸的二次多項式擬合，建立回歸方程：Y＝-11.92＋0.057 1A＋0.094B＋0.065C＋0.19D－0.000 157A2－0.001 26B2－0.001 49C2－0.001 23D2，對模型進行方差分析，結果列于表3。由表3可知，所選模型不同處理間差異極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著，試驗方法可靠性高；變異系數為5.37%，表明試驗有很好的穩定性；模型的相關系數R2為0.903 3，校正判定系數為0.813，說明該模型相關性較好。并且模型一次項A，D差異極顯著，二次項A2，B2，C2和D2差異極顯著，表明提取溫度和液料比對葉綠素提取率的主效應明顯。依據系數值A＝0.057，B＝0.094，C＝0.065，D＝0.19可知，因素的主效應關系為超聲提取溫度＞提取時間＞乙醇體積分數＞液料比。

表2 響應面分析方案及結果

2.2.2 響應面分析由圖5～10可知，存在極值的條件應該在圓心處，該模型在試驗范圍內存在穩定點，響應值存在最大值。由圖5可知，葉綠素的提取率隨液料比的增加呈現先快速增長而后緩慢增長的趨勢。增加液料比可增加傳質動力，有助于葉綠素的溶出[15]，但當液料比達到一定程度時，已溶出大部分葉綠素，若再增加溶劑量，葉綠素提取量增加緩慢[16]，這與單因素試驗分析時的結果相吻合。葉綠素提取率的變化速率顯示超聲提取時間的主效應大于液料比，與統計結果相符。

表3 回歸模型方差分析

圖6表明，乙醇體積分數對葉綠素提取率的影響顯著，表現為其曲線較陡。從圖6還可以看出，葉綠素提取率隨著乙醇體積分數的增加呈現先增大后減小的趨勢。液料比與乙醇體積分數的等高線圖為橢圓形狀，表明二者交互效應顯著，與方差分析結果一致。另外，葉綠素提取率的變化速率顯示乙醇體積分數主效應大于液料比，與統計結果相符。圖7表明，葉綠素的提取率隨提取溫度的升高呈現先快速增長而后增長緩慢的趨勢，隨著溫度的升高，植物組織軟化、膨脹，加速了溶劑對葉綠素的滲透力，使葉綠素得率增加[16-18]；當溫度達到一定溫度以后，高溫使熱敏性物質葉綠素被破壞[19]，導致葉綠素得率下降，這與單因素試驗分析時的結果相吻合。另外，葉綠素提取率速率的變化較大，曲線較陡顯示出溫度主效應大于提取時間，與統計結果相符。圖8結果中葉綠素提取率的變化速率顯示超聲溫度主效應大于乙醇體積分數，與統計結果相符。圖9結果中葉綠素提取率的變化速率顯示提取溫度主效應大于液料比，與統計結果相符。圖10表明，葉綠素提取率的變化速率顯示提取時間主效應大于乙醇體積分數，與統計結果相符。

2.2.3 提取工藝條件的驗證由Design-Expert 6.0.5軟件分析可知，最佳的提取參數為：液料比為165.23∶1（mL/g），超聲提取時間為40.66 min，乙醇體積分數為30.81%，提取溫度為50.71℃，此時葉綠素提取率理論值可達到0.593%。將上述條件進行試驗結果的驗證，重復3次實際測得的葉綠素得率分別為0.584%，0.571%，0.579%，平均得率為0.578%。與理論預測值相比，相對誤差約為2.53%。說明優化后的工藝具有實踐指導意義。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，采用響應面優化得到的主效應關系為：提取溫度＞超聲時間＞乙醇體積分數＞液料比。由軟件分析得出最佳參數為：液料比為165.23∶1（mL/g），超聲時間為40.66min，乙醇/丙酮混合溶劑中乙醇體積分數為30.81%，提取溫度為50.71℃，此時葉綠素提取率可達到0.593%。

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Optimization of Ultrasonic Extraction of Chlorophylls fromCornus officinalisLeaves by Response Surface Methodology

SHI Shu-hong1，HAOJian-ping1，WANGQiu-bao1，ZHAOYu-chen2，YANGWen-fei1
（1.College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.CultivatingHerbs FarmofShanxi Province，Jiangxian 043610，China）

Taking Cornus officinalis as the research object,the application of center composite design was used to design this experiment on the basis ofsingle factor experiment,the paper optimized the extraction conditions:the liquid-material ratio,ultrasonic time, alcohol concentration and extract temperature.The result showed that the chlorophyll extraction rate could be up to0.593%with following factors,ratioofliquid tosolid of165.23∶1（mL/g）,extraction time of40.66 min,ethanolcon centration of30.81%（V）ofethanol/acetone solvent,and extraction temperature of50.71℃.

Cornus officinalis leaves;chlorophyll extraction;center composite design;response surface methodology

R284.2

A

1002-2481（2016）03-0310-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.10

2015-11-10

史淑紅（1990-），女，山西太原人，在讀碩士，研究方向：藥用植物種質資源。郝建平為通信作者。