堆肥提取液中大麗輪枝菌拮抗放線菌的分離、鑒定

韓超，李欣欣，2，韓建榮

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院現代農業研究中心，山西太原030031）

堆肥提取液中大麗輪枝菌拮抗放線菌的分離、鑒定

韓超1，李欣欣1，2，韓建榮1

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院現代農業研究中心，山西太原030031）

采用稀釋涂布法，從堆肥提取液中分離到放線菌菌株46株；然后采用五點對峙拮抗試驗進行初篩，獲得10株對大麗輪枝菌具有拮抗作用的放線菌菌株；通過考察放線菌菌株發酵濾液的拮抗效果，最終篩選出對大麗輪枝菌拮抗效果最強的菌株G19，其初篩和復篩12 d時抑菌率分別達到51.8%和50.7%。經16S rDNA序列同源性分析，G19菌株與鏈霉菌屬灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens）同源性為99%，結合形態特征、生理生化性質，最終將G19菌株鑒定為灰略紅鏈霉菌。

堆肥提取液；大麗輪枝菌；拮抗放線菌；分類鑒定

大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）是半知菌亞門輪枝孢屬真菌，是一種主要的土傳病害病原菌，病原菌除危害草莓外，還危害棉花、茄子、番茄、甜瓜、黃瓜等作物，病菌可以菌絲體、厚垣孢子或擬菌核在土壤中存活5～8 a，因此，帶菌土壤是病害侵染的主要來源[1]。近幾年來，由大麗輪枝菌引發的土傳病害正在逐年加重。土傳病害一旦發生則很難控制，實行輪作、選用健康無病種苗、選用抗病性強的種子、土壤消毒、加強栽培管理等之前慣用的方法，效果均不明顯，目前，實際生產中只有使用大劑量的化學農藥才能對其有所控制，而化學農藥的過度使用會使病原菌抗藥性增強、農藥在植物上殘留加重，嚴重威脅生態環境和食品安全。因此，利用生物防治的手段來減少病害的發生或是降低病害的發展速度顯得非常重要。而高效拮抗菌的篩選又是生物防治研究的基礎。

堆肥提取液是指堆制腐熟的有機物料經過不同的方法提取后的水提取液。近年來研究結果表明，不同來源的固體廢棄物堆肥或者它們的提取液對于土傳病原菌有明顯的抑制效果，可發展成一種替代化學農藥防治某些植物病害的有效手段[2]。徐大兵[3]研究認為，堆肥提取液的抑菌作用主要是其中的微生物對植物病原菌的拮抗作用，而堆肥提取液中的微生物主要有細菌、霉菌、放線菌。聶太禮等[4]研究表明，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對引發棉花黃萎病的大麗輪枝菌有顯著的抑制效果。孫崇思等[5]研究發現，萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）對大麗輪枝菌有明顯的拮抗作用；武翠紅[6]研究發現，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）對大麗輪枝菌也有較好的拮抗效果。孟娜等[7]和李雪玲等[8]的研究結果均表明，木霉菌（Trichoderma）對大麗輪枝菌有很好的生物防治作用。

放線菌是一類具有多種用途和價值的微生物，放線菌及其代謝物經常被用于研制微生物農藥，其中用于植物病害生物防治的放線菌主要是鏈霉菌屬及其相關類群[9]。本研究從堆肥提取液中分離得到了46株放線菌，通過5點對峙拮抗試驗和無菌發酵濾液拮抗試驗篩選出1株對大麗輪枝菌具有高效拮抗作用的菌株，并通過形態學觀察、生理生化試驗以及16S rDNA基因序列分析，對其進行了分類鑒定，旨在為大麗輪枝菌高效生防菌劑的研究和開發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試堆肥

秸稈牛糞堆肥由玉米秸稈和牛糞混合堆制發酵而成；菌糠堆肥由白靈菇菌糠配合牛糞進行堆制發酵而成。

1.2 供試病原菌

大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）購自ACCC（中國農業微生物菌種保藏管理中心）。

1.3 主要試劑

溶菌酶、蛋白酶K和PCR試劑及DNA Marker等購自上海生工生物技術服務有限公司，其余試劑均購自中國醫藥集團山西有限公司。

1.4 主要培養基

放線菌的分離采用高氏一號培養基，放線菌發酵液的制備采用液體高氏一號培養基，病原菌的保藏、培養采用PDA培養基，拮抗放線菌的初篩和復篩采用PDA培養基。放線菌的培養特征觀察所用培養基為：高氏一號培養基、馬鈴薯浸汁培養基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養基、甘油天冬素培養基、無機鹽淀粉培養基、燕麥汁培養基。

1.5 堆肥提取液的制備

將2種堆肥分別以肥水比1∶5（堆肥20 g和無菌水100 mL）混合加入250 mL的三角瓶中，將瓶口密封后置于25℃的培養箱中厭氧避光培養3 d。每天定時搖動三角瓶2次，使堆肥中的微生物和養分充分溶解。最后用4層紗布過濾，制得堆肥提取液。

1.6 放線菌的分離純化

采用稀釋涂布法，對制得的堆肥提取液進行梯度稀釋，將10-3，10-4，10-5等3個梯度的稀釋液各0.2 mL，均勻涂布于高氏一號（每300 mL培養基中加入1 mL3%的K2Cr2O7溶液）平板上，28℃倒置培養5～7 d后，對單菌落進行分離純化，并保存于高氏一號試管斜面上。

1.7 拮抗放線菌的初篩

采用5點對峙培養法，用打孔器從長滿大麗輪枝菌的平板上打制出7 mm的菌餅，用接種鏟將菌餅轉接至PDA平板中央，然后用接種針將分離到的放線菌接種至距離中央菌餅2 cm對稱的4點處，每個平板接種一種放線菌。以不接種放線菌為對照。25℃恒溫倒置培養8 d后測量其拮抗效果，拮抗效果用抑菌帶寬（抑菌帶寬是指拮抗菌和病原菌中心連線上的無菌區域）和抑制率[10]表示。

抑菌率＝（對照病原菌生長直徑－處理病原菌生長直徑）/對照病原菌生長直徑×100%。

1.8 拮抗放線菌的復篩

經初篩篩選出拮抗效果較明顯的放線菌，用5mm的打孔器打取菌餅各2個，接種到裝有100mL高氏一號液體培養基的250 mL三角瓶中，28℃，150 r/min搖床振蕩培養7 d，發酵液于4℃，4 000 r/ min離心5 min后，先用0.45 μm的無菌微孔濾膜過濾，再用0.22 μm的無菌微孔濾膜過濾除菌，得到無菌濾液，將無菌濾液與冷卻至50℃的PDA培養基以1∶4的比例混合均勻后倒入培養皿[11]，用7 mm的打孔器打取培養15 d的大麗輪枝菌菌餅，置于加入濾液的PDA平板中央，每個處理設置3個重復，同時以不加濾液的PDA平板作對照，28℃培養8 d后，每隔48 h用十字交叉法測量病原菌生長直徑，并計算抑菌率。對初篩和復篩的結果進行綜合比較，篩選出拮抗效果最優的放線菌。

1.9 拮抗放線菌的鑒定

1.9.1 形態特征觀察在高氏一號培養基上利用插片法培養拮抗效果最優的放線菌，在光學顯微鏡下觀察其菌絲體、孢子絲和孢子形態。分別在高氏一號培養基、馬鈴薯浸汁培養基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養基、甘油天冬素培養基、無機鹽淀粉培養基、燕麥汁培養基[12]上觀察其菌落形態。

1.9.2 生理生化試驗明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉酶的活性、硫化氫產生、黑色素產生、碳源利用等生理生化試驗均按照文獻[13]的方法進行。

1.9.316 SrDNA序列分析用改良的CTAB法[14]提取DNA。應用16S通用引物（27F:5′-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′；1541r：5′-AAGGAGGTGATC CAGCCGCA-3′）進行PCR擴增，PCR 50 μL反應體系為：ddH2O31μL，10×PCRbuffer5 μL，dNTP2 μL，引物（20 μmol/L）各5 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶1 μL。反應條件為：預變性94℃，5 min；變性94℃，30 s，延伸72℃，90 s，35個循環；72℃保溫10 min。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測后送上海生工生物技術有限公司測序。將得到的序列在NCBI數據庫中進行核酸序列BLAST，經過比對分析，找出最大同源性序列。

2 結果與分析

2.1 拮抗放線菌的初篩

分別從秸稈牛糞堆肥提取液和菌糠堆肥提取液中分離到放線菌26，20株。利用平板5點對峙拮抗試驗，從46株放線菌中篩選出對大麗輪枝菌具有拮抗效果的放線菌菌株10株（表1）。

表1 放線菌對大麗輪枝菌的抑制作用

根據拮抗帶寬度和抑制率大小來比較拮抗效果，其中，G10，G19的拮抗效果最明顯，拮抗帶寬度在第8天分別達到7.3，7.0 mm，在第12天時拮抗帶寬度分別為5.0，4.1 mm，并且在第12天時抑制率分別達到51.6%和51.8%（表1）。

2.2 拮抗放線菌的復篩

在初篩結果基礎上，選擇拮抗效果較好的5株放線菌，根據其無菌發酵濾液的拮抗效果進行復篩，復篩結果如圖1所示。

由表2可知，菌株G19在12 d時的抑菌率達到最高，為50.7%，而在初篩結果中拮抗效果較好的菌株G10在復篩中的效果最差，12 d時抑制率僅為3.4%，G28菌株的抑菌率相對于初篩的結果也有較明顯的下降。

表2 拮抗放線菌無菌發酵濾液的抑菌效果

2.3 拮抗放線菌G19菌株的鑒定

放線菌G19在高氏一號培養基上菌落圓形，邊緣整齊，氣生菌絲開始為白色，之后變為灰色，基內菌絲開始無色，之后變為栗棕色，淀粉水解能力強，有明顯的水解圈，40倍顯微鏡下可見其菌絲形態和螺旋孢子絲，菌絲直或彎曲狀，分支較多，氣生菌絲上有螺旋形孢子絲（圖2）。根據這些特征，將菌株G19鑒定為鏈霉菌。G19在高氏一號培養基、馬鈴薯浸汁培養基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養基、甘油天冬素培養基、無機鹽淀粉培養基、燕麥汁培養基上生長情況良好，與灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens）培養特征基本一致[15]（表3）。G19菌株的14項生理生化特性與灰略紅鏈霉菌[16]基本吻合（表4）。

表3 G19菌株與灰略紅鏈霉菌在6種培養基上的培養特征比較

表4 G19菌株與灰略紅鏈霉菌的生理生化特性比較

2.4 G19菌株的16S rDNA序列分析

經測序獲得G19菌株的16S rDNA基因序列全長為1 463 bp。用NCBI數據庫中BLAST工具進行同源性對比后發現，G19菌株的16S rDNA序列與灰略紅鏈霉菌MMH9（GenBank登錄號：KR133 201.1）序列的相似度為99%。結合顯微形態、培養特征和生理生化特征綜合比較后發現，G19菌株在碳源利用中不能利用蔗糖、棉籽糖、阿拉伯糖，這與灰略紅鏈霉菌的碳源利用特性一致。在6種培養基上的培養特征也大部分相同，因此，初步鑒定G19菌株為灰略紅鏈霉菌。

3 結論與討論

堆肥提取液中不僅含有大量植物生長所需的養分，也含有大量的有益微生物。其中的微生物可以通過多種方式減少植物病害的發生，之前的研究中，國內外學者已經對細菌中芽孢桿菌（Bacillus）和霉菌中的木霉（Trichoderma）的生防效果進行了比較詳細的報道，而對拮抗放線菌的報道還不太多。本研究從秸稈牛糞堆肥提取液和菌糠堆肥提取液中分離出46株放線菌，經過初篩和復篩，獲得1株具有較強拮抗效果的放線菌G19菌株。

初篩結果表明，在分離出的46株放線菌中有10株對大麗輪枝菌有拮抗作用，分別用拮抗帶寬度和抑菌率來評價菌株拮抗效果，其中，拮抗帶寬度隨時間減小的主要原因是因為其抑菌強度不夠，另外，拮抗放線菌菌落的長大也是原因之一。選擇初篩中拮抗效果較好的5株放線菌進行復篩，復篩探究無菌發酵濾液的拮抗效果，根據初篩和復篩結果可知，G19菌株對大麗輪枝菌的拮抗效果最好，12 d時的抑菌率分別達到51.8%和50.7%。由此可見，G19菌株的拮抗性能高效且穩定，有潛力成為一種能高效抑制大麗輪枝菌的拮抗菌菌劑，為新型綠色生物農藥的研制提供支持。而菌株G10的復篩與初篩結果出現極大反差，無菌發酵濾液幾乎沒有明顯的拮抗效果，這可能與菌株和發酵液的抑菌機理不同有關，也可能是由于發酵液中的某種抑菌物質在試驗過程中遭到破壞而失去效果。所以，研究拮抗放線菌的抑菌機制和分析發酵液的成分是下一步要完成的工作。

本研究在16S rDNA序列同源性分析基礎上，結合形態特征和生理生化特征，對放線菌菌株G19進行了分類鑒定，16S rDNA序列分析結果表明，G19菌株序列與灰略紅鏈霉菌的同源性為99%；生理生化結果表明，G19菌株不能利用蔗糖、棉籽糖、阿拉伯糖，這和灰略紅鏈霉菌的碳源利用特征一致，結合不同培養基上的培養特征也大致相同，最終將G19菌株鑒定為灰略紅鏈霉菌。

針對灰略紅鏈霉菌國內外學者已經進行了多方面的研究，楊文鴿等[17]研究發現，灰略紅鏈霉菌對革蘭氏陽性細菌有明顯的抑菌效果；朱本偉等[18]研究結果表明，灰略紅鏈霉菌代謝產物粗提物對于金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和大腸桿菌（Escherichia coli）等具有顯著抑制活性；葉亮等[19]研究證明了灰略紅鏈霉菌抗腫瘤代謝物穩定性好。Al-Askara等[20-21]研究認為，灰略紅鏈霉菌有很強的抗真菌活性。本研究結果表明，灰略紅鏈霉菌對土傳病害病原菌大麗輪枝菌有顯著的抑制效果，可以為土傳病害的生物防治提供理論依據。

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Isolation and Identification of Antagonistic Actinomycetes ofVerticillium dahliaefrom Compost Extracts

HANChao1，LI Xin-xin1，2，HANJian-rong1
（1.College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Research Center ofModern Agriculture，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

46 strains of actinomycetes were isolated from compost extracts by dilution coating method,10 strains of actinomycetes which had an antagonistic effect on Verticillium dahliae were screened out by five point confrontation experiment.Through the investigation of the antagonistic effect of the fermentation filtrate of actinomycetes strain,strain G19 with the strongest antagonistic effect was screened out,its inhibition rate reached 51.8%and 50.7%,respectively,in the two screening.By analysis of 16S rDNA sequence homology,the homology of G19 strain with Streptomyces griseorubens was 99%.Finally,the G19 strain was identified as Streptomyces griseorubens bymorphological and physiological characteristics.

compost extracts;Verticillium dahliae;antagonistic actinomycetes;taxonomic identification

S141.4；Q939.13＋2

A

1002-2481（2016）03-0328-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.14

2016-01-22

韓超（1989-），男，山西長治人，在讀碩士，研究方向：資源微生物。韓建榮為通信作者。