通脈養心丸對阿霉素慢性心臟毒性大鼠的保護作用研究

呂清波，潘均華，王玉晶，徐津鵬，王怡，舒樂新

（1．天津中醫藥大學，天津 301617；2．天津中新藥業集團股份有限公司樂仁堂制藥廠，天津 300112）

阿霉素是一種周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用，常作為一線抗腫瘤藥物用于多種腫瘤的治療，但阿霉素毒性較大，長期應用可導致機體臟器組織毒性損傷，其中臨床上以心臟毒性損傷最常見，這限制了阿霉素的臨床應用[1]。阿霉素導致的心臟毒性可分為急性、慢性和遲發性[2]，急性心臟毒性可在治療結束后2周內出現臨床表現；慢性心臟毒性常發生在用藥后1年內，表現為左心室功能障礙，病情呈進展性改變，最終可發展為心力衰竭；遲發性慢性心臟毒性在化療結束后數年甚至數十年后才發生[3]。此外，阿霉素心臟毒性反應呈劑量依賴性[4]，研究發現患者因服用阿霉素所誘發的心臟疾病事件隨著阿霉素治療累積劑量的增加而增加[5]。阿霉素致心臟毒性機制目前尚不明確，普遍認為是多因素共同作用的結果[6]，如自由基的產生[7]、鈣超載[8]、炎癥反應[9]、線粒體損傷[10]、細胞凋亡[11]和細胞自噬[12-13]等。研究和防治阿霉素慢性心臟毒性具有重大意義。

目前西醫防治阿霉素心臟毒性的藥物較少，右雷佐生（DRZ）是唯一一種經美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的可減輕阿霉素引起的心臟毒性的藥物[14]，為打破治療單一現狀，許多研究者將目光轉向中醫藥，并且發現中醫藥在減輕阿霉素引起的心臟毒性方面亦可發揮作用，通脈養心丸便是其一，通脈養心丸源于漢代張仲景《傷寒論》記載的炙甘草湯，后經由名老中醫董曉初、阮士怡在經方炙甘草湯和生脈飲基礎上進一步改良成的一種中成藥[15-16]。臨床上，通脈養心丸常用于治療冠心病心絞痛、心律失常、心力衰竭等心血管疾病，并表現出了良好的臨床效果[17]。此外黃景玉等[18]通過臨床觀察發現通脈養心丸可緩解阿霉素所致心臟損傷，改善患者的生活質量。現代藥理研究發現，通脈養心丸具有較好的氧自由基清除能力，可減輕氧化應激損傷，可通過抑制炎癥因子的表達來發揮抗炎作用[19]，此外，還可通過抑制鈣超載來減少心肌細胞的凋亡[20]。本研究將通過建立阿霉素致慢性心臟毒性大鼠模型，探討通脈養心丸對阿霉素慢性心臟毒性大鼠的保護作用，期望為研究阿霉素致心臟毒性動物研究提供參考，為通脈養心丸拮抗阿霉素致慢性心臟毒性的臨床應用提供依據。

1 實驗材料

1.1 主要儀器 萬分之一天平（型號：BP121S，德國Sartorius公司）；Ⅱ導聯心電圖（型號：ML408，天津開發區福斯特科技發展有限公司）；電子天平（型號：TD5002G，天津天馬衡基儀器有限公司）；全自動生化分析儀（型號：ZSE，日本日立公司）；Visual Sonics Vevo?2100小動物超聲成像系統（加拿大）。

1.2 藥品及試劑 通脈養心丸（批號：1070353，天津中新藥業集團樂仁堂制藥廠）；阿霉素（批號：427D023，索萊寶公司）；羧甲基纖維素納（CMC-Na，批號：C8621，北京索萊寶科技有限公司）；異氟烷（批號：C002160404，河北一品制藥股份有限公司）；肌酸激酶（CK，YZB/0695-2010中生北控生物科技股份有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）（A006-2中生北控生物科技股份有限公司）。

1.3 實驗動物 Wistar大鼠，雄性，體質量（200±20）g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證編號：SCXK（京）2016-0006。

2 實驗方法

2.1 實驗分組及給藥 健康的雄性Wistar大鼠共44只，按隨機數字表法隨機分為3組，分別為：空白對照組（n=8），模型組（n=24）和給藥組（n=12）。分籠喂養，各組大鼠均給予普通飲食，自由飲水，記錄所有大鼠每次給藥前后體質量，同時觀察大鼠的一般狀況。

空白對照組：按體質量2．5 mg/kg腹腔注射生理鹽水，每周1次，持續注射8周。按體質量10 mL/kg灌胃CMC-Na，每日1次，連續8周。

模型組：參照文獻方法[21]，用生理鹽水將阿霉素粉劑溶解成0．1 mg/mL的溶液，按體質量2．5 mg/kg腹腔注射阿霉素溶液，每周1次，連續8周，阿霉素累積劑量20mg/kg；按體質量10mL/kg灌胃CMC-Na，每日1次，連續8周。

給藥組：按體質量2．5 mg/kg腹腔注射阿霉素，每周1次，持續注射8周，阿霉素劑量20 mg/kg；用CMC-Na將通脈養心丸溶解成0．1 g/mL溶液，給藥組按體質量1 g/kg灌胃通脈養心丸溶液，每日1次，連續8周。

8周后各組均停藥，連續觀察2周。期間每天喂養，觀察記錄。

2.2 大鼠一般狀態觀察 整個實驗過程中詳細記錄大鼠的體質量，飲水量和飲食量，每周稱質量2次以便調整給藥量。觀察各組大鼠的精神狀態、毛色光澤、活動強度，體毛有無脫落，糞便，是否腹瀉等情況，同時記錄各組大鼠死亡情況。

2.3 大鼠心電圖檢測 實驗開始前先將各組大鼠進行心動圖檢測，實驗開始第1、4、8及10周分別對大鼠進行心電圖檢測，異氟烷氣體麻醉大鼠，麻醉后仰臥位固定大鼠，再將相應電極插入到右上肢及左下肢皮下，記錄大鼠心電圖數據。

2.4 大鼠超聲心動檢測 第1、4、8及10周對大鼠進行心動超聲檢測。將大鼠胸部褪毛，稱質量標記，用異氟烷麻醉大鼠，麻醉后用膠帶將大鼠腹部向上固定于操作臺，均勻涂抹一層超聲耦合劑于大鼠胸部，通過調整操作臺位置，得到最佳的左心室，主動脈和二尖瓣瓣葉，獲得圖像。位置不變，選取M型超聲長軸切面，獲得M型圖像，連續采集15 s，進行測量。獲得左室射血分數（EF）、左室短軸縮短率（FS）、左室舒張末期內徑（LVIDd）和左室收縮末期內徑（LVIDs）數值。

2.5 大鼠心臟指數 第10周將大鼠處死，迅速開胸，先找到腹主動脈，再沿主動脈根部游離出心臟，用手術剪將大血管殘端、筋膜和脂肪組織剔除，分離出全心，用預先配制好的生理鹽水沖洗去殘留的血液，用濾紙將水分吸干，在分析天平上稱量全心濕質量，并根據以下公式計算心臟指數。

心臟指數（%）=全心濕質量（g）/大鼠體質量（g）×100%。

2.6 心肌酶學生化檢測 第1、4及8周大鼠眼眶取血；第10周大鼠腹主動脈取血。取血后標記，靜置 30 min，3 500 r/min，離心半徑 8．3 cm，離心 10 min，取血清分裝于1．5 mL離心管，一部分-4℃冰箱冷藏，24 h之內用全自動生化檢查儀進行CK及LDH的檢測。另一部分置于-80℃冰箱冷凍保存，備用。

2.7 大鼠心肌組織形態學觀察 第10周將各組大鼠處死，分離心臟，迅速取心臟，用甲醛液固定，待組織完全固定后，經過修整、常規脫水、組織透明、包埋、切片和蘇木素-伊紅（HE）染色等實驗操作后，制成病理切片，在光鏡下觀察心肌組織形態學改變。

2.8 結果統計學處理 使用SPSS 24．0統計軟件系統進行分析，各組的數據結果用均值±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析（One-way，ANOVA），組間兩兩比較采用 LSD 法。P＜0．05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 大鼠的一般狀態變化 模型組大鼠精神狀況較差，先出現狂躁，后變得喜蜷縮，甚至出現精神萎靡，毛色失去光澤，飲食量下降，活動強度減弱，消瘦等，但給予通脈養心丸治療后，大鼠一般情況好轉，給藥組大鼠精神情況較好于模型組。各組大鼠體質量在第4周時逐漸增長，但與空白對照組相比，模型組及給藥組體質量低于空白對照組大鼠體質量，增長較慢。各組大鼠平均周飲食量、飲水量比較無統計學差異（P＞0．05）。見圖1。

圖1 大鼠一般情況變化（±s）Fig.1 Changes in general conditions of rats（±s）

給予阿霉素4周時，空白對照組大鼠死亡3只；模型組大鼠死亡3只；給藥組大鼠死亡3只。給予阿霉素8周時，模型組大鼠死亡5只；給藥組大鼠死亡4只。給予阿霉素10周時，模型組大鼠死亡7只，給藥組大鼠死亡5只。其中空白組大鼠是在心電圖及超聲檢測時麻醉而死亡，模型組及給藥組大鼠由于阿霉素的作用，腹瀉嚴重，體質較差而死亡。

3.2 大鼠心電圖檢測結果 第1周，與模型組相比，給藥組呼吸頻率（RR）間期顯著縮短（P＜0．01），心率顯著升高（P＜0．01），差異均具有統計學意義。第4周，與空白對照組相比，模型組RR間期顯著延長（P＜0．01）、心率顯著降低（P＜0．01）；與模型組相比，給藥組 RR間期縮短（P＜0．05），心率升高（P＜0．05），差異均具有統計學意義；第8周，測定結果無統計學差異（P＞0．05）；第10周，與空白對照組相比，模型組QRS間期延長（P＜0．05），差異具有統計學意義。見圖2。

圖2 心電圖變化結果（±s）Fig.2 Results of ECG changes（±s）

3.3 大鼠超聲心動圖檢測結果 給藥第1周，與模型組比較，給藥組 LVIDd增高（P＜0．01），差異具有統計學意義；給藥第4周，與空白對照組相比，模型組 EF、FS 顯著降低（P＜0．01），LVIDs、LVIDd 顯著增高（P＜0．01），差異均具有統計學意義；與模型組相比，給藥組 FS 顯著增高（P＜0．05），差異具有統計學意義。給藥第8周，與空白對照組相比，模型組EF降低（P＜0．05），FS 顯著降低（P＜0．01），LVIDs增高（P＜0．05），差異均具有統計學意義；第 10 周，與空白對照組相比，模型組與給藥組EF、FS顯著降低（P＜0．01），差異具有統計學意義。見圖3。

圖3 超聲心動圖檢測結果（±s）Fig.3 Results of echocardiography（±s）

3.4 大鼠心臟指數的變化 與空白對照組比較，模型組大鼠的心臟質量顯著降低（P＜0．01），差異具有統計學意義；心臟指數組間差異無統計學意義。見圖4。

圖4 大鼠心臟指數的檢測結果（±s）Fig.4 Results of cardiac index of rats（±s）

3.5 大鼠血清CK及LDH含量檢測結果 給藥第1周，各組比較差異均無統計學意義；給藥第4周，與模型組相比，給藥組CK 水平降低（P＜0．05），差異具有統計學意義。給藥第10周，與空白對照組相比，模型組 LDH 增高（P＜0．01）；與模型組相比，給藥組 LDH降低（P＜0．05），差異均具有統計學意義。見圖5。

圖5 大鼠血清心肌酶檢測結果（±s）Fig.5 Serum myocardial enzyme test results of rats（±s）

3.6 大鼠心肌組織HE染色結果 HE染色可見空白對照組大鼠心肌細胞排列整齊，心肌間隙正常，無炎性細胞浸潤；模型組心肌細胞排列紊亂，出現不同程度的空泡變性與水腫，細胞間隙較對照組明顯增寬，大量炎性細胞浸潤，部分肌原纖維溶解，心肌纖維斷裂；給藥組心肌細胞排列較整齊，少量空泡和水腫出現，少量炎性細胞浸潤，心肌細胞間隙明未見明顯增寬。見圖6。

圖6 大鼠心肌組織HE染色結果Fig.6 HE staining results of rat myocardial tissue

4 討論

根據阿霉素致心臟毒性的臨床表現，可將其歸屬為中醫的“心悸”[22]，病機為虛實兩端，氣虛為本，因虛致實，辨證分型為氣陰兩虛，脈絡瘀阻[23]。通脈養心丸由地黃、雞血藤、麥冬、甘草、五味子、黨參等11味中藥組成，具有益氣養陰、通脈止痛之功，對冠心病兼有心悸、心律失常之氣陰兩虛證有很好的治療效果。通過觀察通脈養心丸對大鼠原代心肌細胞缺氧損傷作用發現，通脈養心丸能夠顯著上調超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）活性，降低丙二醛（MDA）含量及炎性因子白介素6、白介素1β濃度[19-20]，這表明通脈養心丸可降低缺氧誘導的心肌細胞內鈣離子濃度的升高以及心肌細胞凋亡。

目前，較為常見的評價蒽環類藥物心臟毒性的指標是超聲心動圖，用其顯示的EF值和FS值降低來評估心臟功能受損[24-26]。本次實驗結果表明，第4、8、10周時模型組較空白對照組EF、FS顯著降低，給藥組LVIDs升高，給藥組與模型組相比FS顯著增高，表明服用通脈養心丸后，阿霉素大鼠心臟功能改善；CK、LDH是評價心肌損害程度的客觀指標，阿霉素可引起血清中CK、LDH水平升高。模型組CK水平呈上升趨勢，給予通脈養心丸后CK水平呈下降趨勢，模型組LDH水平呈明顯上升趨勢，給予通脈養心丸4周后LDH呈下降趨勢，說明通脈養心丸可減輕阿霉素致心臟毒性大鼠的心肌損傷；此外，與空白對照組比較，模型組與給藥組大鼠的心臟質量顯著降低，給藥后其心臟質量及心臟指數均呈上升趨勢，差異有統計學意義，說明通脈養心丸能改善阿霉素大鼠左心室結構，增強心臟功能。綜合以上結果，表明通脈養心丸能有效抑制阿霉素對心肌組織的毒性損傷作用，改善阿霉素導致的慢性心臟毒性。

通過對給藥不同時間段的藥效學指標進行評價，明確了阿霉素誘導的慢性心臟毒性的阿霉素累積劑量范圍，通過通脈養心丸進行干預，結果顯示通脈養心丸對阿霉素的慢性毒性有一定的保護作用。但由于本實驗只是作為觀察通脈養心丸是否對阿霉素心臟毒性有保護作用的一個初期探討，在實驗中只設計了同于臨床有效劑量的中劑量組，接下來將圍繞通脈養心丸的不同給藥劑量對阿霉素慢性心臟毒性的影響進行探討，并探討通脈養心丸保護阿霉素慢性心臟毒性作用機制。