安腸愈瘍湯對潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜屏障的修復作用及機制研究*

孫大娟，王晗潞，王帥，遲莉麗

（1．山東中醫藥大學附屬醫院脾胃病科，濟南 250000；2．山東中醫藥大學第一臨床醫學院，濟南 250000）

潰瘍性結腸炎（UC）是一種涉及感染、免疫、遺傳等多因素的慢性非特異性炎癥性腸病[1]。近20年來，中國UC的發病率急劇增加[2]，但其發病機制仍未完全闡明，目前認為腸黏膜屏障功能受損是其重要病理改變，與疾病的發生發展密切相關[3]，故維護腸黏膜屏障的完整性和通透性是其治療的關鍵[4-5]。目前西醫治療藥物主要以5-氨基水楊酸、糖皮質激素、生物制劑等為主[6]，療效確切、起效快，但不良反應大、復發率高[7]。中藥具有修復腸黏膜損傷等作用，可長期維持緩解、降低復發率，在防治UC方面具有獨特優勢[8-11]。前期臨床實驗[12-15]發現安腸愈瘍湯具有健脾理氣、化濕助運、清熱解毒的作用。本研究在前期研究基礎上，進一步從動物實驗方面觀察安腸愈瘍湯對UC大鼠咬合蛋白（Occludin）、緊密連接蛋白 1（Claudin-1）及白細胞介素-13（IL-13）/酪氨酸激酶（JAK1）/信號轉導與轉錄激活因子6（STAT6）信號通路的調控作用，探討其修復腸黏膜屏障的機制，為中醫藥治療UC提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 36只SPF級雄性SD大鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，體質量（200±20）g，動物合格證號：SCXK（魯）20190003，動物倫理審查批件號：AWE-2019-002。動物飼養于山東中醫藥大學附屬醫院動物實驗中心，溫度20～26℃，相對濕度40%～70%，12 h光照和12 h避光循環交替。

1.1.2 實驗藥品 安腸愈瘍湯是山東省名中醫遲莉麗教授自擬方，藥物組成：生黃芪30g，敗醬草30g，黃連 9g，黃芩 9g，炒白術 30g，薏苡仁 30g，木香 9g，檳榔 15 g，地榆炭 15 g，白及 15 g，當歸 9 g，炒白芍12 g，防風6 g，生甘草9 g。藥材購于山東中醫藥大學附屬醫院中藥房，并在本院制劑室浸泡、煎煮、過濾、濃縮，按照所需配成高、中、低濃度藥液，生藥含量為分別為 0．375、0．75、1．5 g/mL，置于 4 ℃冰箱保存。美沙拉嗪緩釋顆粒（法國Ethypharm公司，批號：190108）。

1.1.3 主要試劑和儀器 葡聚糖硫酸鈉（DSS，MW36000-50000）（美國 MP Biomedicals公司，批號：0216011080）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1120）；兔多克隆IL-13抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-0560R）；兔單克隆STAT6抗體、JAK1抗體（英國Abcam 公司，批號：ab217998、ab133666）；兔單克隆Occludin抗體、Claudin-1抗體（英國Abcam公司，批號：ab167161、ab180158）；辣根酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：Cat．#ZB-2301）；Claudin-1、Occludin、JAK1、STAT6、IL-13、PCR引物均由寶日醫生物技術（北京）有限公司設計合成。全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業發展有限公司）；冷凍高速離心機（美國Thermo Scientific公司）；RT-6000自動酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；FluorChem Q蛋白印跡成像和定量分析系統（美國Proteinsimple公司）；電泳、電轉系統（美國BIO-RAD公司）；PCR儀（德國Roche公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模及分組給藥 大鼠適應性飼養1周后，采用隨機數字表法隨機分為6組：空白組（6只），模型組（6只），中藥低、中、高劑量組（各6只，簡稱低、中、高劑量組）和美沙拉嗪對照組（6只）。除空白組外，其余各組均連續7 d自由飲用4．5%DSS溶液，并于飲用DSS溶液第2天開始進行藥物灌胃，依據《實驗動物和動物實驗技術》動物給藥量計算，根據大鼠與人的體表面積等效劑量比值進行折算，中藥低、中、高劑量組分別給予含生藥為 0．375、0．75、1．5 g/mL的中藥灌胃，美沙拉嗪對照組以0．035 g/mL的美沙拉嗪混懸液灌胃，空白組、模型組均以去離子水灌胃，以上各組均每次2 mL，每日1次，連續2周。

1.2.2 標本的采集與處理 干預結束后，將大鼠麻醉后取距肛門1 cm以上的結腸組織，沖洗干凈后，肉眼觀察炎癥、潰瘍情況，取病變最明顯的組織，一部分結腸組織固定、包埋、切片后，HE染色，由2名經驗豐富的病理科醫師顯微鏡下觀察，并參照文獻[16]進行組織病理學評分。另一部分結腸組織于-80℃冰箱凍存，分別用于Occludin、Claudin-1蛋白、基因表達及IL-13、JAK1、STAT6的基因表達。

1.2.3 Western Blot法檢測 Occludin、Claudin-1 蛋白的表達 先于液氮中研磨、裂解結腸組織，離心收集上清液，提取總蛋白，采用蛋白濃度測定（BCA）測定其濃度。取含有40 μg的蛋白溶液為上樣量，經電泳、轉膜、封閉后，分別加入結合一抗、二抗，再分別洗膜后，避光顯色2 min，再置于全自動化學發光圖像分析系統中進行掃描。量化標準為目標蛋白灰度值與標準蛋白灰度值的比。

1.2.4 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測結腸組織 Occludin、Claudin-1、IL-13、JAK1、STAT6 的表達 參照RNAiso Plus說明書采用RNAiso Plus提取總RNA，逆轉錄為cDNA、熒光定量PCR試劑盒進行熒光定量PCR反應，以GADPH為內參，2-ΔΔCt法計算，引物序列見表1。擴增引物見表1。

表1 目的基因與內參基因引物序列信息表Tab.1 Primer sequence information of target genes and internal reference genes

1.3 相關性分析 除空白組外，將各組中檢測的Occludin和Claudin-1基因表達量逐一與 JAK1、STAT6、IL-13的基因表達量使用Spearman相關分析，計算出相關系數（γ），測定P值，從而分析各指標之間的相關性。

1.4 統計學分析 采用SPSS 24．0統計軟件，計量資料用均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。相關性分析采用Pearson線性相關，P＜0．05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠結腸組織病理學變化

2.1.1 病理學觀察結果 模型組結腸組織結構不完整，局部可見隱窩消失及隱窩炎，大量淋巴漿細胞浸潤，炎癥累及黏膜下層。空白組結腸組織結構完整，隱窩結構存在，密集排列，固有層少量淋巴漿細胞浸潤。低劑量組結腸組織結構較模型組好轉，隱窩結構輕度改建，固有層大量炎性細胞浸潤。高劑量組、美沙拉嗪組結腸組織趨于正常，隱窩結構改建，少量炎細胞浸潤。中劑量組結腸組織病理變化程度介于低劑量組和高劑量組之間。見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織病理改變（HE，×200）Fig.1 Pathological changes of colon tissue in rats of each group(HE，×200)

2.1.2 病理學評分結果 與空白組比較，模型組結腸組織病理學（HPS）評分升高（P＜0．01）；與模型組比較，各用藥組 HPS 評分均下降（P＜0．01），其中高劑量組低于低、中劑量組（P＜0．01 或 P＜0．05），差異均具有統計學意義；高劑量組與美沙拉嗪組比較，差異無統計學意義（P＞0．05）。見表2。

表2 各組大鼠結腸黏膜組織病理學評分（±s）Tab.2 Colon mucosal histopathology score of rats in each group（±s） 分

表2 各組大鼠結腸黏膜組織病理學評分（±s）Tab.2 Colon mucosal histopathology score of rats in each group（±s） 分

注：與空白組比較，**P＜0．01；與模型組比較，##P＜0．01；與美沙拉嗪組比較，△△P＜0．01。

組別 動物數 HPS評分空白組 6 2．50±2．07模型組 6 15．33±1．51**低劑量組 6 9．50±2．51##△△中劑量組 6 5．33±1．16##△△高劑量組 6 1．83±1．60##美沙拉嗪組 6 2．83±1．17##

2.2 各組大鼠結腸組織Occludin、Claudin-1的蛋白及基因相對表達水平比較

2.2.1 Occludin、Claudin-1的蛋白表達 1）Occludin表達：模型組較空白組明顯下調（P＜0．01），各用藥組較模型組均明顯上調（P＜0．01）；美沙拉嗪組不同程度優于低、中劑量組（P＜0．01 或 P＜0．05），差異均具有統計學意義。與高劑量組差異無統計學意義（P＞0．05）。2）Claudin-1 表達：模型組較空白組下調（P＜0．01），各用藥組較模型組均上調（P＜0．01），美沙拉嗪組優于低、中劑量組（P＜0．01），差異均具有統計學意義。與高劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0．05）。見表3、圖2。

表3 各組大鼠結腸組織Occludin、Claudin-1蛋白表達（±s）Tab.3 Expression of Occludin and Claudin-1 protein in rat colon of each group（±s）

表3 各組大鼠結腸組織Occludin、Claudin-1蛋白表達（±s）Tab.3 Expression of Occludin and Claudin-1 protein in rat colon of each group（±s）

注：與空白組比較，**P＜0．01；與模型組比較，##P＜0．01；與美沙拉嗪組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。

組別 動物數 Occludin Claudin-1空白組 6 1．00±0．00 1．00±0．00模型組 6 0．45±0．12** 0．66±0．03**低劑量組 6 0．71±0．13##△△ 0．83±0．02##△△中劑量組 6 0．96±0．12##△ 0．98±0．04##△△高劑量組 6 1．05±0．14## 1．25±0．13##美沙拉嗪組 6 1．11±0．03## 1．42±0．20##

圖2 各組大鼠結腸組織Occludin、Claudin-1蛋白變化Fig.2 Changes of Occludin and Claudin-1 protein in colonic tissues of rats in each group

2.2.2 Occludin、Claudin-1的基因表達 1）Occludin基因表達：模型組較空白組下調（P＜0．05），各用藥組較模型組均上調（P＜0．01），美沙拉嗪組不同程度優于低、中劑量治療組（P＜0．01 或 P＜0．05），差異均具有統計學意義。與高劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0．05）。2）Claudin-1 基因表達：模型組較空白組下調（P＜0．01），各用藥組較模型組均上調（P＜0．01），美沙拉嗪組優于低、中劑量組（P＜0．01），差異均具有統計學意義。與高劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0．05）。見表4。

表4 各組大鼠結腸組織Occludin、Claudin-1基因表達（±s）Tab.4 Expression of Occludin，Claudin-1 gene in colon of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠結腸組織Occludin、Claudin-1基因表達（±s）Tab.4 Expression of Occludin，Claudin-1 gene in colon of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，##P＜0．01；與美沙拉嗪組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。

組別 動物數 0ccludin Claudin-1空白組 6 1．00±0．00 1．00±0．00模型組 6 0．60±0．10* 0．58±0．08**低劑量組 6 0．79±0．15##△△ 0．84±0．15##△△中劑量組 6 1．02±0．18##△ 1．01±0．15##△△高劑量組 6 1．18±0．21## 1．31±0．22##美沙拉嗪組 6 1．30±0．20## 1．51±0．21##

2.3 各組大鼠結腸組織IL-13、JAK1、STAT6基因轉錄水平變化

2.3.1 IL-13基因表達 模型組較空白組下調（P＜0．01），中、高劑量組及美沙拉嗪組較模型組均上調（P＜0．01），差異具有統計學意義；低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0．05）；美沙拉嗪組優于中、低劑量組（P＜0．01），差異具有統計學意義。與高劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0．05）。見圖3。

圖3 各組大鼠結腸組織IL-13基因變化Fig.3 Changes of IL-13 gene in colon tissue of rats in each group

2.3.2 JAK1基因表達 模型組與空白組相比，差異有統計學意義（P＜0．01），中、高劑量組及美沙拉嗪組較模型組均不同程度下調，差異具有統計學意義（P＜0．05 或 P＜0．01），低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0．05）；美沙拉嗪組優于低劑量組，差異具有統計學意義（P＜0．05），與高劑量組、中劑量組比較差異無統計學意義（P＞0．05）。見圖4。

圖4 各組大鼠結腸組織JAK1基因變化Fig.4 Changes of JAK1 gene in colonic tissues of rats in each group

2.3.3 STAT6基因表達 模型組與空白組相比，差異有統計學意義（P＜0．01），各用藥組與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0．01）；美沙拉嗪優于低、中劑量組，差異具有統計學意義（P＜0．01），與高劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0．05），見圖5。

圖5 各組大鼠結腸組織STAT6基因變化Fig.5 Changes of STAT6 gene in colon tissue of rats in each group

2.4 相關性分析結果 對Occludin和Claudin-1基因表達量逐一與JAK1、STAT6、IL-13的基因表達量使用Spearman相關分析，結果發現，Occludin和Claudin-1與 JAK1、STAT6表達水平呈負相關，Occludin和Claudin-1與IL-13表達水平呈正相關，Occludin、Claudin-1 與 JAK1、STAT6、IL-13 的基因表達量具有相關性，具體數值見表5。

表5 Occludin、Claudin-1 與 JAK1、STAT6、IL-13的相關性分析Tab.5 Correlation analysis of Occludin，Claudin-1 and JAK1，STAT6，IL-13

3 討論

UC的治療目標逐漸由誘導并維持臨床緩解、黏膜愈合、防治并發癥轉變為快速誘導緩解、長期維持緩解、完全的黏膜愈合等[17]。最近更提出了深度緩解和達標治療的新策略[18-20]，即經過治療后，達到和緩解，這是治療UC的終極目標。因此治療的關鍵是修復受損的腸黏膜屏障。Claudin-1蛋白作為腸黏膜機械屏障中緊密連接蛋白Claudins家族的一員，主要維護腸黏膜機械屏障的完整性和通透性[21]。Occludin蛋白是緊密連接中最重要的結構蛋白，參與緊密連接形成的信號調節[22-23]，研究表明，Occludin、Claudin-1表達下調，腸道通透性增加，導致腸腔內的細菌、抗原物質移位激活免疫細胞反應，是UC發生的重要機制之一[24]。因此，上調Occludin、Claudin-1表達水平可以修復腸黏膜屏障，可能是治療UC的重要靶點。

近年來研究發現[25]，針對JAK/STAT通路的靶向治療是修復腸黏膜屏障功能的重要突破點。STAT家庭共有7個成員，其中STAT6被證明在UC發病過程中可能發揮著重要的負性調節作用[26-28]。研究表明[29-30]，IL-13主要的信號通路為JAK/STAT途徑，在UC中，抗炎細胞因子IL-13與IL-13RA結合，通過JAK/STAT途徑，磷酸化STAT6，啟動轉錄以調節免疫應答反應，參與腸上皮細胞的緊密連接、抗凋亡和黏膜修復過程。所以，通過激活IL-13/JAK/STAT6信號通路，加速腸道屏障功能的修復，是治療UC的核心環節。

Kim等[31]研究發現：細胞模型實驗中STAT3核轉位增多，Occludin等多種腸屏障結構的蛋白基因表達降低。衛江鵬等[32]研究亦顯示，UC患者腸黏膜Occludin和Claudin-1蛋白表達低于正常腸黏膜，而STAT3蛋白高于正常腸黏膜，兩者間呈負相關，且病情越嚴重，相關性越明顯。本研究結果也顯示，安腸愈瘍湯各用藥組Occludin、Claudin-1基因、蛋白表達水平較模型組均不同程度上調，且高劑量組效果較好。除低劑量組外其余用藥組不同程度激活IL-13/JAK1/STAT6通路的基因表達，高劑量組、美沙拉嗪組效果最好。Occludin和Claudin-1與JAK1、STAT6表達水平呈負相關，與IL-13表達水平呈正相關，提示Occludin、Claudin-1基因表達可能與IL-13/JAK/STAT信號通路有相關性，中藥安腸愈瘍湯可能通過激活IL-13/JAK1/STAT6信號通路，上調Occludin和Claudin-1的表達水平，促進UC大鼠腸黏膜修復。通過激活IL-13/JAK1/STAT6信號轉導通路修復腸黏膜屏障，可能是治療UC的一個新靶點。