不同劑量丁苯酞對UUO小鼠腎組織Nrf-2表達的影響

曹義甫，王秀芬，王天智，解坤，劉翠紅，李英

不同劑量丁苯酞對UUO小鼠腎組織Nrf-2表達的影響

曹義甫1，王秀芬2△，王天智1，解坤3，劉翠紅1，李英2

目的 探討不同劑量丁苯酞（NBP）對單側輸尿管梗阻（UUO）小鼠腎間質纖維化的作用，并探討核轉錄因子-E2相關因子2（Nrf-2）表達水平與腎間質纖維化的關聯性。方法清潔級CD-1雄性小鼠72只隨機均分為低劑量丁苯酞（NBPL）組、高劑量丁苯酞（NBPH）組、假手術（Sham）組和模型（UUO）組。除Sham組外，均制作UUO模型，NBPL、NBPH組自術后第1天始分別給予NBP 150 mg/（kg·d）、220 mg/（kg·d）灌胃。Sham及UUO組亦自術后第1天始均給予等量生理鹽水灌胃，每天每公斤體質量入量恒定，直至處死。各組分別于術后第3、7、14天處死6只小鼠，取梗阻側腎組織做免疫組化染色檢測Ⅰ型膠原蛋白的表達，Western Blot檢測7 d和14 d時Nrf-2、Ⅰ型膠原蛋白的表達。結果免疫組化結果顯示，UUO組Ⅰ型膠原蛋白的IOD值隨時間延長呈增高趨勢，Sham組、NBPL組和NBPH組呈降低趨勢（P＜0.05）。UUO組、NBPL組和NBPH組各時點IOD值均較Sham組增高，NBPL、NBPH組較UUO組降低，且NBPH組低于NBPL組（P＜0.05）。Western Blot結果顯示，7 d和14 d時，UUO組、NBPL組和NBPH組Nrf-2、Ⅰ型膠原蛋白IOD值均較Sham組增高；NBPL、NBPH組Nrf-2蛋白IOD值較UUO組升高，而Ⅰ型膠原蛋白降低；NBPL組Nrf-2的IOD值低于NBPH組，而Ⅰ型膠原蛋白高于NBPH組（均P＜0.05）。結論NBP對UUO小鼠腎間質纖維化有一定的改善作用，作用機制可能與上調腎組織Nrf-2的表達，下調Ⅰ型膠原蛋白的表達有關。

輸尿管梗阻；疾病模型，動物；膠原Ⅰ型；丁苯酞；NF-E2相關因子2；腎間質纖維化

機體內氧化還原水平失衡是腎臟疾病重要的病理生理基礎之一。氧化應激參與了腎間質纖維化的發生、發展，而腎間質纖維化可導致慢性腎衰竭［1］。因此，切斷氧化應激途徑可避免腎功能衰竭的發生、發展。近年來研究發現，核轉錄因子（NF）-E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2）的抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）通路在機體的抗氧化應激中起關鍵作用；因此，干預Nrf-2的表達，可切斷氧化應激途徑，進而有可能阻止腎間質纖維化的發生、發展［2］。目前，尚少見通過此途徑抑制腎間質纖維化的研究報道。丁苯酞（dl-3-n·butylphthalide，NBP）具有抗氧化、抗炎、保護線粒體等功能，在腦神經損傷治療中被廣泛應用，但在腎保護方面的研究鮮見。本研究擬通過建立單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）誘導的小鼠腎間質纖維化模型，探索不同濃度NBP對梗阻性腎病小鼠的腎保護作用，并分析梗阻性腎病小鼠腎臟中Nrf-2、Ⅰ型膠原蛋白的表達情況。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑COL1A1抗體（Santa Cruz），Nrf2抗體（Santa Cruz），GAPDH抗體（Santa Cruz），辣根酶標記抗兔IgG（ABCAM Ltd），辣根酶標記抗山羊IgG，生物素標記抗山羊IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；復日生物電泳圖像分析系統（上海復日科技有限公司）；VECTASTAIN ABC試劑（Vector Laboratories公司）。

1.2 方法

1.2.1 UUO模型的制備2個月齡、體質量為50 g左右的清潔級、雄性CD-1小鼠72只，購自河北中醫學院動物中心，采用隨機數字表法均分為低劑量NBP（NBPL）組、高劑量NBP（NBPH）組、假手術（Sham）組及模型（UUO）組。除Sham組外，余各組小鼠用10%水合氯醛以0.4 mL/100 g體質量行腹腔注射，充分麻醉后剪去左腎腰背部鼠毛，并以0.9%鹽水擦洗，繼而予以乙醇消毒皮膚。以左側脊肋角旁開0.5 cm為手術部位，用外科剪刀剪開皮膚，沿脊柱擴大刀口，長約1.0～1.5 cm，逐層分離皮膚、皮下組織以及肌肉，暴露腎臟。以平頭鑷子提取腎周組織，充分暴露腎臟手術視野。并用鑷子分離輸尿管，用3-0縫合線分別從腎近極和遠極結扎輸尿管，并從中間離斷輸尿管。逐層縫合腹壁切口、腹膜肌層及皮膚層，對切口進行乙醇消毒。Sham組除不結扎輸尿管外，其余同上述方法。UUO術后發現梗阻腎發生間質纖維化損害為模型制作成功。本組造模均成功。NBPL、NBPH組自術后第1天始分別給予NBP 150 mg（/kg·d）、220 mg（/kg·d）灌胃。Sham及UUO組亦自術后第1天始均給予等量生理鹽水灌胃，每天每千克體質量入量恒定，直至處死。實驗期間動物自由攝食水，每天注意觀察小鼠的一般狀況，有無飲食及活動異常。

1.2.2 標本的采集和處理各組分別于術后第3、7、14天各處死6只小鼠，取梗阻側腎組織，生理鹽水沖洗后置入10%中性福爾馬林固定，分別應用80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇2 h脫水透明，然后浸蠟、包埋、切片。備免疫組化染色；另取部分梗阻側腎組織放入液氮中，-70℃冷凍保存以防止蛋白降解，待后續實驗。

1.2.3 免疫組化檢測Ⅰ型膠原蛋白表達水平使用二甲苯、梯度乙醇對組織切片分別進行脫蠟及水化，并應用自來水沖洗5 min左右，應用0.3%H2O2去離子水孵育30 min，再于緩沖液稀釋的一抗中孵育30 min，緩沖液沖洗切片5 min；于滴加生物素標記的二抗中孵育30 min，緩沖液沖洗切片5 min；組織置于VECTASTAIN ABC試劑30 min，緩沖液沖洗切片5 min；組織在過氧化物酶底物溶液中孵育，達到所需的染色強度后自來水沖洗、復染、脫水至透明。使用Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件對免疫組織化學實驗結果進行分析，每張切片隨機抽取5個視野對腎組織的病變情況進行積分光密度（IOD）分析。

1.2.4 Western Blot檢測Nrf-2、Ⅰ型膠原蛋白的相對表達水平分別于7 d和14 d時各組取500～600 mg腎組織加入1 mL提取液勻漿提取，1∶1稀釋提取上清液，用考馬斯亮藍方法測定提取液的蛋白濃度，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并行蛋白質的電轉移（水浴式電印跡）。放入5%牛血清白蛋白BSA的封閉液中，在室溫條件下搖動4～5 h或靜止過夜。加一抗稀釋1∶250，室溫搖動1～3 h或4℃過夜；Tween-PBS洗3次，每次振蕩10 min。二抗結合，二抗稀釋1∶6 500；室溫搖動1～2 h。Tween-PBS洗3次，每次振蕩10 min，使用ECL發光試劑反應后，洗膜、曝光、洗片。數碼相機照相，使用Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件，測定不同時間點、不同組條帶的IOD值，以GAPDH為內參，測定Nrf-2、Ⅰ型膠原蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學方法采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料用表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，NBPH組的Nrf-2與Ⅰ型膠原蛋白關系采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠腎臟組織病理肉眼觀察Sham組腎臟顏色及大小正常，其余各組小鼠腎臟均有不同程度增大，其中尤以UUO組腎臟增大最為明顯，NBPL、NBPH組腎臟外觀大體變化均較UUO組輕。

2.2 各組Ⅰ型膠原蛋白免疫組化結果比較組內比較：隨時間延長，UUO組IOD值呈增高趨勢，Sham組、NBPL組和NBPH組呈逐漸降低趨勢（P＜0.05）。組間比較：UUO組、NBPL組和NBPH組各時點IOD值均較Sham組增高，NBPL、NBPH組IOD值較UUO組降低，且NBPH組低于NBPL組（P＜0.05），見表1、圖1。

Tab.1 Comparison of immunohistochemical staining results of typeⅠcollagen in renal tissue between four groups表1 各組腎組織Ⅰ型膠原蛋白的免疫組化染色結果比較（n=6，IOD×10-3，）

Tab.1 Comparison of immunohistochemical staining results of typeⅠcollagen in renal tissue between four groups表1 各組腎組織Ⅰ型膠原蛋白的免疫組化染色結果比較（n=6，IOD×10-3，）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與UUO組比較，c與NBPL組比較，A與3 d比較，B與7 d比較，P＜0.05

F組別Sham組UUO組NBPL組NBPH組F 3 d 67.01±9.73 130.92±5.51a 120.76±38.67ab 110.80±33.91abc 27.801＊7 d 63.49±4.30A 158.90±18.50aA 103.61±0.10abA 90.22±8.30abcA 23.412＊14 d 60.11±4.70AB 217.00±56.40aAB 87.41±12.54abAB 69.81±35.32abcAB 19.109＊32.211＊16.201＊21.621＊23.010＊

2.3 Nrf-2、Ⅰ型膠原蛋白Western Blot檢測結果比較7 d和14 d時，UUO組、NBPL組和NBPH組Nrf-2、Ⅰ型膠原蛋白IOD值均較Sham組增高；NBPL、NBPH組Nrf-2蛋白IOD值較UUO組升高，而Ⅰ型膠原蛋白降低；NBPL組Nrf-2的IOD值低于NBPH組，而Ⅰ型膠原蛋白高于NBPH組（均P＜0.05），見表2、圖2。

Tab.2 Comparison of Nrf-2 and typeⅠcollagen expression levels between four groups表2 各組小鼠腎組織Nrf-2和Ⅰ型膠原蛋白相對表達水平比較（n=6，IOD×10-3，）

Tab.2 Comparison of Nrf-2 and typeⅠcollagen expression levels between four groups表2 各組小鼠腎組織Nrf-2和Ⅰ型膠原蛋白相對表達水平比較（n=6，IOD×10-3，）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與UUO組比較，c與NBPL組比較，P＜0.05

組別Sham組UUO組NBPL組NBPH組FNrf-2 7 d 0.238±0.008 0.352±0.007a 0.445±0.011ab 0.614±0.019abc 98.256＊14 d 0.229±0.013 0.336±0.003a 0.453±0.005ab 0.703±0.022abc 109.904＊Ⅰ型膠原蛋白7 d 0.341±0.011 0.968±0.011a 0.750±0.005ab 0.565±0.006abc 99.106＊14 d 0.349±0.010 1.120±0.091a 0.693±0.006ab 0.439±0.008abc 110.036＊

2.4 相關性分析NBPH組Nrf-2與Ⅰ型膠原蛋白表達水平呈負相關（r=-0.841，P＜0.05）。

Fig.2 The Nrf-2 and type I collagen protein expressions in three groups圖2 各組小鼠腎組織中Nrf-2和Ⅰ型膠原蛋白表達

3 討論

3.1 Nrf-2的抗氧化應激機制Nrf-2是亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族（CNC）成員之一，正常生理條件下，Nrf-2在細胞質中與Keap1結合，作為E3泛素連接酶的適配底物；當受到外界氧化應激因子刺激后，Nrf-2與Keap1解偶聯進入細胞核，啟動下游基因轉錄翻譯，發揮相應的調控作用。研究顯示，Nrf-2對多種細胞及組織器官具有保護作用，能對抗多種疾病的病理狀態［3-4］，除了可對抗心腦血管疾病、肺纖維化、肝臟纖維化等疾病以外，還對腎臟疾病如缺血再灌注腎損傷、藥物性腎損傷、腎臟纖維化等具有保護作用［5-6］。Cho等［7］研究顯示，激活Nrf-2和上調ARE介導的抗氧化應激相關酶類基因均可以減輕腎組織纖維化、抑制活性氧簇（ROS）。

3.2 NBP的抗氧化應激、抗腎間質纖維化作用研究顯示，NBP可通過多種機制減輕缺血性細胞和組織損傷，具有較強的抗組織缺血作用，可明顯縮小局部臟器缺血的損傷面積，改善機體能量代謝和缺血區的微循環和血流量，抑制組織細胞凋亡［8］。NBP可能通過降低花生四烯酸含量，提高腦血管內皮一氧化氮（NO）和前列腺環素（PGI2）的水平，抑制谷氨酸釋放，降低細胞內鈣濃度，從而通過抑制自由基和提高抗氧化酶活性等機制發揮上述作用［9］。目前，仍缺乏NBP對腎間質纖維化保護作用機制的系統研究。在對體外氧糖剝奪的內皮細胞抗氧化應激的研究中發現，NBP可以抑制線粒體內過多的過氧化反應［10］。另有研究顯示，NBP可減少線粒體ROS和過氧化亞硝酸鹽的產生，并可減少ROS誘發的基質金屬蛋白酶（MMP）的降低，阻斷因MMP丟失而觸發的進一步的細胞損傷及凋亡［11］。這些研究提示NBP可通過抑制氧化應激的途徑防止線粒體受損，進一步減少細胞凋亡、減少細胞纖維化的發展。

3.3 NBP可上調Nrf-2的表達、抑制Ⅰ型膠原蛋白的形成UUO的特點是：腎呈進行性小管萎縮及間質纖維化，小管和間質細胞增生，腎實質巨噬細胞、單核細胞浸潤，這些改變最終導致小管間質纖維化和小管萎縮，腎實質被纖維組織取代，而腎小球相對不受影響。腎間質纖維化的病程漫長，病因復雜，加上取材的局限性，對其病理過程的動態研究比較困難［12］。因此，本研究僅觀察3個時間點，希望能從中找到疾病演變的規律性。本研究Ⅰ型膠原蛋白的免疫組化結果顯示，隨時間延長，UUO組IOD值呈增高趨勢，Sham組、NBPL組和NBPH組呈逐漸降低趨勢；UUO組、NBPL組和NBPH組各時點IOD值均較Sham組增高，NBPL、NBPH組IOD值較UUO組降低且NBPL組高于NBPH組，表明在應用不同濃度NBP治療后，腎間質損傷及腎小管上皮細胞在第7天均開始改善，Ⅰ型膠原蛋白表達開始減少，14 d時療效更佳，且NBPL組在7 d、14 d的治療效果不如NBPH組。Western Blot研究結果顯示，不同時間點在UUO組、NBPL組、NBPH組小鼠腎組織中2種蛋白均有表達，而NBPL、NBPH組較UUO組Nrf-2蛋白表達進一步增多且NBPL組低于NBPH組，而3組Ⅰ型膠原蛋白與Nrf-2蛋白表達趨勢相反，筆者推測NBP治療腎間質纖維化的機制可能與激活Nrf-2信號通路有關，提示在一定濃度范圍內，在抑制腎間質纖維化的發生、發展中，NBP濃度越高，氧化應激反應分子Nrf-2越易被激活，其表達也隨之增高，抑制Ⅰ型膠原蛋白的形成也越明顯，短期內抗氧化作用越強，但NBP最優劑量需要進一步探討。相關性分析顯示，Nrf-2與I型膠原蛋白表達水平呈負相關，進一步驗證了上述作用機制。

綜上所述，Nrf-2/ARE通路可能是阻止氧化應激損傷的重要靶點。NBP的抗氧化應激作用有望成為緩解腎間質纖維化的新途徑。其作用機制可能是激活Nrf-2氧化應激通路，抑制ROS產生，從而緩解腎間質損傷，最終達到延緩腎間質纖維化的目的。

（圖1見插頁）

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（2016-06-12收稿 2016-08-11修回）

（本文編輯 陸榮展）

The effects of different doses of butylphthalide on Nrf-2 expression in mouse model with unilateral ureteral obstruction

CAO Yifu1,WANG Xiufen2△,WANG Tianzhi1,XIE Kun3,LIU Cuihong1,LI Ying2
1 Department of Nephrology,the Third Hospital of Shijiazhuang,Shijiazhuang 050031,China；2 The Third Hospital of Hebei Medical University；3 Shijiazhuang Cardio-Cerebrovascular Disease Hospital△

ObjectiveTo explore the impact of different doses of butylphthalide on renal interstitial fibrosis in mice with obstructive nephropathy,and to discuss the correlation between Nrf-2 expression level and renal interstitial fibrosis.MethodsTotally 72 male CD-1 mice of clean grade were selected and randomly assigned into 4 groups:sham operation group(Sham),model group(UUO),low dose of butylphthalide group(NBPL)and high dose of butylphthalide group(NBPH). In addition to the control group,UUO model was established in other three groups.NBPL group was given NBP 150 mg/(kg· d)by gavage since postoperative day 1，NBPH group was given NBP 220 mg/(kg·d)by gavage.Sham group and UUO group were given equal volume of saline by gavage.Six mice were sacrificed at the third,7th,14th day,respectively.The obstructive renal tissue was selected for immunohistochemical staining and Western blot assay.The expression levels of Nrf-2 and typeⅠcollagen were detected by Western blot assay.ResultsThe IOD value of typeⅠcollagen was increased with time in UUO group,and which showed a gradual decreasing trend in Sham group,NBPL group and NBPH group(P＜0.05).The IOD values at different time points were significantly higher in UUO group,NBPL group and NBPH group compared to those of Sham group.The IOD values were significantly decreased in NBPL and NBPH groups than that of UUO group,and IOD value was lower in NBPH group than that of NBPL group(P＜0.05).Western blot assay showed that IOD values of Nrf-2 and typeⅠcollagen at 7 d and 14 d were increased in UUO group,NBPL group and NBPH group compared with those of Sham group.The IOD values of Nrf-2 protein were increased,and IOD values of typeⅠcollagen were decreased,in NBPL group and NBPH group than those of UUO group.The IOD value of Nrf-2 protein was decreased in NBPL group than that of NBPH group,but the IOD value of typeⅠcollagen was increased in NBPL group than that ofNBPH group(P＜0.05).ConclusionNBP can improve renal interstitial fibrosis in UUO mice,which may be related with the increased expression of Nrf-2 and the down-regulated expression of type I collagen.

ureteral obstruction；disease models,animal；collagen typeⅠ；dl-3-n·butylphthalide；NF-E2-related factor 2；renal interstitial fibrosis

R692

A

10.11958/20160533

河北省醫學科研重點課題計劃（ZD20140125）

1石家莊市第三醫院腎內科（郵編050031）；2河北醫科大學第三醫院（西院）腎內科；3石家莊市心腦血管病醫院

曹義甫（1977），男，主治醫師，碩士，主要從事腎間質纖維化、腎小球疾病、血液透析通路研究

△通訊作者E-mail:wangxiufen@medmail.com.cn