臍血干細(xì)胞移植對嚴(yán)重冠心病患者左心室重塑的改善作用

蔣智 賈中申,2 韋方,2△ 李安杰 周永剛 梁青龍 周松

(1.貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽，550002；2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽，550004)

·論 著·

臍血干細(xì)胞移植對嚴(yán)重冠心病患者左心室重塑的改善作用

蔣智1賈中申1,2韋方1,2△李安杰1周永剛1梁青龍1周松1

(1.貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽，550002；2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽，550004)

目的 研究異體臍帶血干細(xì)胞(UCBSC)移植對嚴(yán)重冠心病患者左心室重塑的作用。 方法 將40例冠狀動脈造影為三支血管彌漫病變的冠心病患者隨機分為對照組和UCBSC組，均給予常規(guī)內(nèi)科藥物治療，UCBSC組在此基礎(chǔ)上經(jīng)冠狀動脈前降支移植UCBSCs。移植前、移植后48 h、4周、12周分別檢測血清Ⅰ型前膠原羧基端肽(PICP)、Ⅲ型前膠原氨基末端前肽(PCⅢNP)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平，用心臟超聲檢測左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)值。結(jié)果 UCBSC組患者均未發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)及移植相關(guān)不良反應(yīng)。與對照組及移植前相比，UCBSC組在移植后48 h血清VEGF水平顯著升高(P<0.01)，血漿PICP、PCⅢNP水平降低(P<0.01)，且VEGF變化與PICP、PCⅢNP呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。移植后12周，UCBSC組LVESd小于對照組(P<0.05)，但LVEF差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 嚴(yán)重冠心病患者經(jīng)冠脈移植異體UCBSCs安全有效，通過上調(diào)VEGF表達(dá)可抑制心臟纖維化，從而改善左室重塑。

冠心病； 臍帶血干細(xì)胞； 異體移植； 膠原； 心室重塑

冠心病已成為嚴(yán)重危害我國人民生命健康的疾病[1]。穩(wěn)定型心絞痛患者冠狀動脈造影約有10%為三支血管病變，其中部分嚴(yán)重彌漫性病變患者介入或搭橋手術(shù)風(fēng)險極高。心臟長期慢性缺血可引起心肌細(xì)胞間基質(zhì)纖維化，導(dǎo)致心臟擴大、心功能不全，被稱為缺血性心肌病[2]。動物研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血干細(xì)胞(umbilical cord blood stem cell，UCBSC)經(jīng)靜脈移植可上調(diào)家兔心肌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)水平，從而促進(jìn)血管新生[3]。VEGF不僅可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移形成新生血管[4]，還與細(xì)胞外基質(zhì)的膠原代謝密切相關(guān)[5]。我們推測UCBSCs移植治療缺血性心肌病可通過提高VEGF表達(dá)水平改善心室重塑，因此本研究納入嚴(yán)重彌漫性三支血管病變的冠心病患者，經(jīng)冠狀動脈移植UCBSCs，觀察其對血漿血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、Ⅰ型前膠原羧基端肽(PICP)、Ⅲ型前膠原氨基末端前肽(PCⅢNP)表達(dá)及左室大小和射血分?jǐn)?shù)等指標(biāo)的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2009年1月至2010年12月我科住院的冠心病患者40例，所有患者經(jīng)冠狀動脈造影證實為三支血管彌漫性病變，均無介入手術(shù)及冠脈搭橋指征。男28例，女12例，年齡51～78歲，隨機分為對照組和UCBSC組，均給予常規(guī)內(nèi)科藥物治療，UCBSC組在此基礎(chǔ)上通過冠狀動脈前降支移植UCBSCs。兩組年齡、性別、腎功能、合并高血壓、糖尿病及基礎(chǔ)心功能情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)，均服用阿司匹林、ACEI或ARB、β-受體阻滯劑、他汀類、硝酸脂類和利尿劑等藥物，并排除嚴(yán)重肝腎功能不全、慢性阻塞性肺病、惡性腫瘤和血液系統(tǒng)疾病。該研究方案通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均同意接受異體UCBSCs移植并簽署知情同意書。

表1 入選患者基本情況

1.2 人臍血單個核細(xì)胞的提取與制備

所有臍帶血均采自貴州省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科無妊娠并發(fā)癥、身體健康、新生兒足月分娩(37～40周)的孕婦，均自愿捐獻(xiàn)，同意用于科學(xué)研究和臨床治療。用一次性血袋采集臍帶血80～120 mL，6 h內(nèi)用1.077 g/L Ficoll密度梯度離心分離法分離，吸取中間單個核細(xì)胞層，反復(fù)PBS漂洗，220 μm濾網(wǎng)過濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，最后用20 mL肝素鹽水(20 U/mL)制成單個細(xì)胞懸液，30 min內(nèi)用于移植，移植前臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞。

1.3 臍血單個核細(xì)胞移植

患者取平臥位，常規(guī)消毒鋪巾，2%利多卡因局部麻醉。右橈動脈穿刺建鞘，通過指引導(dǎo)管經(jīng)ATM導(dǎo)絲(泰爾茂，日本)將非快速交換球囊(over-the-wire，強生，美國)送至左前降支。退出鋼絲，4～6 atm充盈球囊，經(jīng)球囊中央孔將UCBSCs單細(xì)胞懸液緩慢推注。全程監(jiān)測心率、血壓、血氧飽和度。

1.4 血VEGF、PICP、PCIIINP檢測

UCBSCs移植前及移植后48 h、4周、12周取外周靜脈血6 mL(早晨空腹時采血,靜置30 min, 3 000 r離心10min,收集上清，-80 ℃保存)，檢測VEGF、PICP、PCIIINP濃度。VEGF試劑盒購自深圳晶美生物制品有限公司，PICP、PCⅢNP試劑盒購自大連泛邦化工技術(shù)開發(fā)有限公司，按照試劑盒說明書操作。

1.5 心臟超聲檢查

UCBSCs移植前及移植后48 h、4周、12周行經(jīng)胸二維心臟超聲評估左室舒張末內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESd)及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。血清VEGF、PICP、PCⅢNP結(jié)果組內(nèi)比較用配對t檢驗，組間比較用獨立樣本t檢驗，VEGF和PICP、PCIIINP用Pearson積矩相關(guān)系數(shù)(r)進(jìn)行相關(guān)性分析，LVEDd、LVESd和LVEF用雙因素方差分析，P<0.05 示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 UCBSCs移植一般情況

UCBSC組每位患者接受移植的細(xì)胞總量為(5.23±2.47)×108，移植前細(xì)胞存活率為(96.1±2.3%)，移植后患者住院觀察48 h，之后隨訪12周，未發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)及移植相關(guān)不良反應(yīng)。

2.2 血清VEGF、PICP和PCⅢNP水平的變化

對照組各時間點血清VEGF、PICP和PCⅢNP水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組及移植前比較，UCBSC組VEGF水平在移植后48 h顯著升高，而PICP和PCⅢNP水平明顯降低(表2)。移植后4周和12周，UCBSC組指標(biāo)較移植前及與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 血清VEGF、PICP和PCⅢNP水平的變化

2.3 VEGF與PICP、PCⅢNP的關(guān)系

移植后48 h血清VEGF與PICP、PCⅢNP呈負(fù)相關(guān)(r=-0.696、-0.775,P<0.01)，說明UCBSCs移植上調(diào)VEGF表達(dá)的水平與抑制纖維蛋白合成的程度呈負(fù)相關(guān)。

2.3 心臟左室內(nèi)徑及射血分?jǐn)?shù)的變化

對照組LVEDd和LVESd值隨時間延長逐漸增加(P<0.01)，EF值逐漸降低(P<0.01)，提示慢性缺血引起左室重塑、心功能降低。與對照組比較，盡管UCBSC組移植后12周的LVEDd和LVEF值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但LVESd小于對照組(P<0.05)，提示UCBSCs移植改善了心室重塑。

表3 不同時間點兩組患者左室直徑及射血分?jǐn)?shù)變化

注：與同時間點對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

3.1 異體干細(xì)胞移植策略的價值

干細(xì)胞移植通過“旁分泌效應(yīng)”促進(jìn)受損心臟修復(fù)具有巨大的潛力[2-6]。已報道的臨床試驗大多移植自體干細(xì)胞[7]，雖然避免了免疫排斥反應(yīng)，但存在以下不足：首先，每個患者都要獲取自身靶細(xì)胞并體外培養(yǎng)增殖，可能錯過疾病治療最佳時間窗；其次，缺血性心肌病患者通常合并高齡、糖尿病、高血壓、高脂血癥等多種伴隨疾病，嚴(yán)重削弱自體干細(xì)胞的治療潛力[8]。因此，學(xué)術(shù)界提出異體干細(xì)胞移植策略，即儲備年輕健康人群來源的高質(zhì)量干細(xì)胞以“現(xiàn)貨”形式供給臨床使用，可節(jié)省大量人力物力，有利于擴大干細(xì)胞治療的規(guī)模從而使更多患者受益[9]。UCBSCs來源豐富，具備取材方便、免疫原性低、有多向分化潛能等優(yōu)點，是近年來倍受矚目的理想“現(xiàn)貨”種子細(xì)胞之一[10]，現(xiàn)已建立起大型UCBSCs庫。免疫排斥反應(yīng)是異體移植最大的風(fēng)險，我們在患者UCBSCs移植后住院觀察48 h，每月隨訪，均未發(fā)現(xiàn)明顯過敏反應(yīng)或移植相關(guān)不良反應(yīng)。

3.2 UCBSCs移植改善心室重塑

心臟基質(zhì)主要成分是Ⅰ型和Ⅲ型膠原，在心室重塑過程中，心臟膠原總量增加，Ⅰ型膠原含量增加，Ⅲ型膠原含量減少，Ⅰ/Ⅲ型膠原比值升高[11]。血清PICP和PCⅢNP水平能較好地反映心肌間質(zhì)Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成水平，是反映心臟纖維化活動程度的指標(biāo)[12]。有文獻(xiàn)[13]報道VEGF表達(dá)水平與肝臟纖維化程度呈正相關(guān)，但我們的前期研究[14-15]發(fā)現(xiàn)經(jīng)冠狀靜脈竇逆行灌注VEGF蛋白可改善內(nèi)皮功能，促進(jìn)心肌梗死區(qū)血管新生，抑制心室重塑，減少心肌梗死面積，改善左室功能。這說明VEGF在不同臟器纖維化進(jìn)程中的作用不同：在肝纖維化中VEGF可能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖形成假小葉加重纖維化；而在心肌纖維化中VEGF可能促進(jìn)血管新生改善心肌灌注從而抑制纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，HCBSCs移植后48 h可明顯降低血漿PICP和PCⅢNP水平，且下降程度與VEGF升高程度呈負(fù)相關(guān)，提示HCBSCs通過上調(diào)VEGF的表達(dá)可抑制心肌間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原合成。移植后4周 UCBSC組患者血清VEGF、PICP和PCⅢNP即恢復(fù)到移植前水平，故我們認(rèn)為UCBSCs移植早期已通過促進(jìn)血管新生減輕基質(zhì)纖維化，并且除上調(diào)VEGF表達(dá)外UCBSCs還可能通過其它機制改善心室重塑。移植后12周UCBSC組患者LVESd值明顯低于對照組，進(jìn)一步說明UCBSCs移植改善了心室重塑。至于12周時兩組患者LVEF差異無統(tǒng)計學(xué)意義，我們認(rèn)為一方面可能因為入選例數(shù)不足，觀察時間過短，不足以顯示UCBSCs移植的效應(yīng)；另一方面，因缺血性心肌病患者心臟擴大、室壁運動不協(xié)調(diào)，評估心臟腔室大小存在誤差[16]，導(dǎo)致數(shù)據(jù)離散度較大。這些問題有待在今后的研究設(shè)計中進(jìn)一步改進(jìn)。

總之，嚴(yán)重冠心病患者經(jīng)冠狀動脈移植異體UCBSCs安全有效，UCBSCs移植可通過上調(diào)VEGF表達(dá)水平抑制心臟纖維化并改善左室重塑。UCBSCs作為“現(xiàn)貨”干細(xì)胞產(chǎn)品治療冠心病具有誘人的發(fā)展前景。

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Transplantation of umbilicalcord blood stem cell attenuated left ventricular remodeling in severe coronary artery disease patients

JiangZhi1,JiaZhongshen1,2,WeiFang1,2,LiAnjie1,ZhouYonggang1,LiangQinglong1,ZhouSong1.

1.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,China. 2.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To investigate the effect of intra-coronary transplantation of allogeneic umbilical cord blood stem cells (UCBSC) on left ventricular remodeling in severe coronary artery disease patients. Methods 40 diffused 3-vessel disease patients were randomly divided into control and UCBSC group. Both groups were administrated with routine medications and UCBSC group was transplanted with UCBSCs through left descending artery. Serum vascular endothelial growth factor (VEGF), carboxy terminal propeptide of procollagen type I (PICP), precollagen type Ⅲ N-peptide (PCIIINP) was measured before, 48 hours, 4 weeks and 12 weeks after UCBSCs transplantation. Left ventricular end diastolic diameter (LVEDd), left ventricular end systolic diameter (LVESd) and left ventricular ejection fraction (LVEF) were evaluated with 2-D echocardiography. Results All patients in UCBSC group did not show any allergic reaction or transplantation related adverse effect. As compared with pre-transplantation and the same timepoint of control group, serum VEGF concentration increased in UCBSC group at 48 h (P<0.01), however, PICP and PCIIINP concentrations decreased (P<0.01). The VEGF and the PICP or PCIIINP showed negative correlation (P<0.01). The LVESd were larger in control group than that in UCBSC group at 12 weeks (P<0.05), but the difference of LVEDd and LVEF showed no significance. Conclusion It is safe and effective that allogeneic UCBSCs transplantation upregulated VEGF expression,reduced myocardial fibrosis and attenuated left ventricular remodeling in severe coronary artery disease patients.

Coronary artery disease； Umbilical cord blood stem cell Allogeneic transplantation; Collagen Remodeling

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金[81460050]，貴州省科技廳貴州省人民醫(yī)院聯(lián)合基金[黔科合LS字(2011)014]，貴州省科技廳科學(xué)技術(shù)基金[黔科合J字(2014)2112號]，貴州省衛(wèi)計委科學(xué)技術(shù)基金[gzwkj2013-1-006]

R-33；R542.2

A

1000-744X(2016)02-0115-04

2015-11-05)

△通信作者，E-mail：w13639087323@qq.com