hnRNP A2/B1在乳腺癌組織中表達水平及其凋亡調控的研究

劉蜀 王蘭 吳培新

(貴陽市婦幼保健院，貴州 貴陽 550003)

hnRNP A2/B1在乳腺癌組織中表達水平及其凋亡調控的研究

劉蜀 王蘭 吳培新

(貴陽市婦幼保健院，貴州 貴陽 550003)

目的 檢測乳腺癌組織標本中hnRNP A2/B1的表達水平；探討hnRNP A2/B1基因對乳腺癌細胞株 MCF-7 凋亡的影響。方法 選取乳腺癌患者40例、乳腺纖維瘤患者20例(對照)，采用免疫組化方法檢測組織中hnRNP A2/B1的表達水平；體外培養乳腺癌細胞株MCF-7，并將hnRNP A2/B1 siRNA轉染至MCF-7中，TUNEL法檢測轉染前后MCF-7細胞的凋亡情況。結果 40例乳腺癌組織標本中36例有hnRNP A2/B1陽性表達，而作為對照的乳腺纖維瘤組織中只有3例有hnRNP A2/B1陽性表達，乳腺纖維瘤組與乳腺癌組hnRNP A2/B1表達水平差異有統計學意義(P<0.01)。體外培養乳腺癌細胞MCF-7在轉染hnRNP A2/B1 siRNA后，MCF-7細胞凋亡明顯增加。結論 hnRNP A2/B1 在乳腺癌組織中的表達較乳腺纖維瘤組織高，推測hnRNP A2/B1與乳腺癌的發生有關。通過siRNA干預、降低hnRNP A2/B1的表達水平可以促進乳腺癌細胞凋亡，提示hnRNP A2/B1可能通過抗腫瘤細胞失巢凋亡實現腫瘤的發生。

乳腺癌細胞; hnRNP A2/B1; 細胞凋亡

乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，全世界每年約有120萬婦女發生乳腺癌，多數于40～45歲死亡[1]。新的觀點認為，細胞癌變是由于信號通路途徑發生了改變，即細胞接受了異常的生長、增殖、分化信號所致[2]。信號分子的異常激活在腫瘤發生、轉移中起非常重要的作用，其中以核內不均一性核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNPs)及相關信號分子的激活尤為矚目[3]。作為hnRNPs家族成員之一的核內不均一核糖核蛋白 A2/B1是脊椎動物前體 mRNA結合蛋白, 是hnRNP 家族的核心成員。一般認為它可能參與了mRNA的轉運和轉錄后調節；此外由于 hnRNPA2 /B1 能結合單鏈 DNA, 故可能在 DNA 復制、轉錄及重組中也起作用[4]。目前越來越多的證據[5]支持 hnRNP A2/B1 與細胞生長調節和癌變存在密切關系。有研究[6-7]發現hnRNP A2 /B1在肺癌組織中表達增高，在口腔與食管癌的鱗癌中以及某些自身免疫病如系統性紅斑狼瘡組織中其表達也出現了上調的現象，但發生機制尚不清楚。本實驗通過檢測hnRNP A2/B1 在乳腺癌組織中的表達情況，并通過siRNA干預、降低hnRNP A2/B1的表達水平，了解其對乳腺癌細胞凋亡的影響，從而推測其是否與乳腺癌的發生相關。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

實驗組：女性40例，選自貴陽市婦幼保健院2005年1月至2009年1月間乳腺癌患者；對照組：女性20例，選自貴陽市婦幼保健院同期乳腺纖維瘤患者。全部病例診斷在術中或術后均經病理學證實，所有乳腺癌病例術前均未接受任何放化療。腫瘤組織取出后10 min內福爾馬林固定，后制成石蠟切片。

1.2 材料

鼠抗人hnRNP A2/B1單克隆抗體(美國Sigma公司)；SP-9002小鼠免疫組化試劑盒(北京中杉金橋公司)；MCF-7乳腺癌細胞株(中科院上海生命科學研究院細胞資源中心)；hnRNP A2/B1的siRNA(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)；0.01M PBS(北京市中杉金橋公司)；濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋)；DMEM培養基、特級胎牛血清(美國Gibico公司)；Protein A/G PLUS Agarose(美國Santa Cruz公司)；complete，Mini，EDTA-Free蛋白酶抑制劑(美國Roche公司)；MTT比色法細胞繁殖定量試劑盒(美國Genmed公司)；Matrigel(美國BD Biosciences公司)；Fibronectin(美國BD Biosciences公司)；TUNEL法細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實驗方法

本實驗在貴陽市婦幼保健院病理科及第三軍醫大學西南醫院乳腺中心實驗室完成。

1.3.1 免疫組化檢測乳腺癌細胞中hnRNPA2/B1的表達 操作流程嚴格按免疫組化試劑盒說明書進行。結果判斷：每例組織切片隨機觀察5個高倍(HPFs×400)視野，并計數500個乳腺癌細胞。陽性細胞比例<5%為(-)； 5%～25%為(+)；25%～50%為(++)；>50%為(+++)[8]。

1.3.2 檢測hnRNP A2/B1對乳腺癌細胞凋亡的影響 (1)設計hnRNP A2/B1的siRNA：應用 Premier5.0軟件設計引物，并交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上游引物 ：5’GGACGCCUUCUCUUAGAGA dTdT 3’；下游引物：3’dTdTCCUGCGGAAGAGAAUCUCU 5’。(2)細胞培養：1)細胞復蘇及培養：將凍存的MCF-7細胞加入5mL DMEM培養基，根據情況對細胞進行換液，待細胞生長至80%以上時可進行細胞傳代。2)細胞傳代：觀察細胞形態，待細胞形態由梭型轉變為圓形后，棄去胰酶并立即加入DMEM培養基終止反應，充分吹打使細胞分散后加入細胞培養瓶中。(3)細胞轉染：按照Promega公司codebreaker siRNA轉染試劑轉染方法進行。(4)Western-Blot檢測蛋白表達水平變化：蛋白樣品制備好后進行蛋白定量(BCA法)，定量方法按照美國PREICE公司提供的BCA Protein Assay Kit說明書操作。然后進行蛋白質SDS-PAGE電泳、轉膜、化學發光、顯影及定影。(5)TUNEL法檢測細胞凋亡： 嚴格按照試劑盒說明書進行。評估方法：在光鏡下以高倍鏡 (×400)隨機選取10 個視野，計算凋亡細胞數及未凋亡細胞數。結果取平均數計算凋亡指數(AI)：凋亡細胞百分率=凋亡細胞總數/細胞總數×100%。

1.4 統計學處理

所有數據用SPSS18.0軟件進行統計分析，多組均數間比較采用相關分析法，兩總體均值比較采用獨立樣本秩和檢驗，P<0.01示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組化檢測hnRNP A2/B1在乳腺癌細胞中的表達

hnRNP A2/B1在乳腺癌細胞中的表達主要位于胞核內，棕黃色顆粒為陽性表達。40例乳腺癌組織標本中36例呈陽性表達，而作為對照的乳腺纖維瘤組織中只有3例有hnRNP A2/B1陽性表達(表1、圖1)。對乳腺癌組與乳腺纖維瘤對照組做兩獨立樣本秩和檢驗，結果顯示乳腺纖維瘤組與乳腺癌組hnRNP A2/B1表達水平差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 兩組組織標本中hnRNP A2/B1陽性表達

圖1 兩組組織標本中hnRNP A2/B1的表達

2.2 hnRNP A2/B1siRNA對乳腺癌細胞凋亡的影響

MCF-7細胞轉染hnRNP A2/B1 siRNA后 ,用熒光二抗進行孵育，于熒光顯微鏡下觀察hnRNP A2/B1的表達 , 48 h左右轉染表達最強。見圖2。

圖2 轉染48h后hnRNP A2/B1的表達

Western-Blot檢測乳腺癌細胞轉染hnRNP A2/B1 siRNA后的表達情況見圖3。

注：1未轉染 2轉染空白質粒 3轉染后

TUNEL法檢測細胞凋亡結果：與未轉染組相比，轉染hnRNP A2/B1siRNA后，MCF-7細胞凋亡發生率明顯升高(圖4)，而轉染GFP的MCF-7細胞與未轉染細胞間無明顯差異。以上結果提示，抑制hnRNP A2/B1活性后可以促進MCF-7乳腺癌細胞凋亡。

圖4 TUNEL法檢測乳腺癌細胞凋亡

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一 ，但其病因及發病機制尚不清楚，影響乳腺癌發病的因素也很多。

hnRNPs及相關信號分子的異常激活在腫瘤發生、轉移中起非常重要的作用。hnRNP是一種核內的 RNA 結合蛋白[9], 是由 30多個蛋白質小分子構成的復合體 ,包括 A1-U 等 30多個小分子, 特別是 A、B組為基本核心成分。hnRNP A2 與hnRNP B1結構相似, 高度同源。一般認為兩者是由同一基因( hnRNP A2/B1)起源, 經過剪接、插入而形成的變異體。因此, 常將兩者合稱為hnRNPA2/ B1。hnRNP A2/B1是一種重要的 RNA 連接蛋白, 是細胞核中異質性細胞核糖蛋白核心復合體的主要成分[10]，參與許多重要的細胞生理作用, 包括RNA 的拼接, Pre-mRNA 的成熟和降解, 端粒、端粒酶DNA 序列的調節,mRNA 由胞核到胞質的轉運和轉錄后調節, 細胞有絲分裂、成熟、分化及凋亡的調節等[11-21]。它在癌細胞和增殖的細胞中過度表達，可能是細胞癌變的原因之一[22]。目前越來越多的證據支持 hnRNP A2/B1 與生長調節和癌變密切相關[23]。此外許多腫瘤都存在微衛星改變(microsatellite alter-ation， MA )和雜合性丟失 (LOH )。有學者[24]發現不僅MA 與 hnRNP A2/B1 表達過度存在統計學意義上的相關性，而且那些有兩個以上 MA 發生位點者更有可能存在 hnRNP A2/B1 的表達過度，提示它有可能是一種癌生長蛋白。同時越來越多的資料表明 hnRNP A2/B1 在良性與惡性組織中的表達存在明顯差異，顯示為正常或良性組織的不表達或低表達以及惡性組織的高表達，甚至于從正常到惡性組織的表達呈遞增現象。

在本實驗中我們發現，40例實驗組乳腺癌組織標本中36例呈hnRNP A2/B1陽性表達，而作為對照組的乳腺纖維瘤組織中只有3例陽性表達，兩組在hnRNP A2/B1表達水平上差異顯著(P<0.01)。這一結果與Pino等[25]的報道基本一致。

hnRNP A2/B1作為一種重要的 RNA 連接蛋白，參與細胞有絲分裂、成熟、分化及凋亡的調節等重要的細胞生理作用。細胞凋亡是生物體內廣泛存在的一種重要生命過程，凋亡對組織器官的生理調節、病理發生和細胞死亡的自身調節作用已被證實，在脫離原來生存環境的特殊情況下發生的細胞凋亡稱為失巢凋亡。失巢凋亡的意義在于防止這些脫落的細胞種植并生長于其它不適宜的地方。而腫瘤細胞，尤其是一些容易發生遠處轉移的惡性腫瘤細胞，具有極強的抗失巢凋亡特性，從瘤體上脫落進入循環系統后并不發生凋亡，從而完成轉移過程。而抵抗失巢凋亡的能力在腫瘤侵襲轉移過程中起著非常重要的作用。本實驗中設計hnRNP A2/B1的siRNA并轉染乳腺癌細胞MCF-7，發現轉染后乳腺癌細胞株MCF-7凋亡明顯增加，說明hnRNP A2/B1 蛋白表達受抑制后，可促進細胞凋亡，這表明hnRNP A2/B1有可能是通過抗凋亡影響乳腺癌發生。

綜上所述，本實驗中我們發現hnRNP A2/B1在乳腺癌組織中的表達顯著增高，推測hnRNP A2/B1高表達可能與乳腺癌的發生有關；通過RNAi干預、降低hnRNP A2/B1的表達水平可以促進乳腺癌細胞凋亡，提示hnRNP A2/B1可能通過抗腫瘤細胞失巢凋亡實現腫瘤的發生和轉移。本實驗結果有助于豐富對乳腺癌發生、轉移分子機制的認識，并為尋找干預乳腺癌侵襲轉移的靶點提供了一定的理論支持，有助于改善乳腺癌患者的預后。

[1] Bland KI， Beenken SW， Copeland EM. The breast In： Brunicardi FC，Ande rson DK， Billiar TR， Dunn DL， Hunter JG， Pollock RE， editors Schwart'z Principiesof surgery 8thed[M]. New York： Mc Graw-H ： 2008： 453-496.

[2] 王仕杰，顧林，李樹玲.等.乳腺癌[M].北京：科學技術出版社，2009：27.

[3] Zech VF，Dlaska M，Tzankov A，et a1．Prognostic and diagnostic relevance of hnRNP A2/B1，hnRNP B1 and S100 A2 in non-small cell lung cancer[J]． Cancer Detect Prey，2011，30(5)：395-402．

[4] Mili S，Shu HJ，Zhao Y，et al. Distinct RNP complexes of shuttling hnRNP proteins with pre-mRNA and mRNA：candidate intermediates in formation and export of mRNA[J]. Mol Cell Biol， 2010， 21 (21) : 7307-7319.

[5] 李潤生,操樂杰.核內不均一核蛋白 A2/B1 在肺癌診斷上的進展[J].國外醫學內科學分冊,2005,32(9):401-404.

[6] Pino I , Pio R, Toledo G, et al . Altered pattern s of expression of members of the heterogeneous nu clear ribonucleo protein ( hnRNP ) family i n l ung cancer[J]. Lung Cancer , 2011, 41( 2 ): 131-143.

[7] Sueoka E, Goto Y, Sueoka N et al . Hetero geneous nuclear ribonucl eoprotein B 1 as a ne w marker of earl y detect i on for hum an lung cancer [J]. Research, 2009 , 59( 7 ) : 1404-1407.

[8] 林嫀.免疫組化檢測在乳腺癌預后及術后化療中的應用[J].臨床腫瘤雜志,2007,12(7):534-536.

[9] 邵志敏.乳腺癌轉移機制的研究及其臨床應用[J].中華乳腺病雜志(電子版), 2009, 3(5)：475-479.

[10] Zech V, Dlaska M, Tzankov A, et al. Prognostic and diagnostic relevance of hnRNP A2/ B1, hnRNP B1 and S100 A2 in non-small cell lu ng cancer [ J] . Cancer Detect Prev, 2006, 30( 5) : 395-402.

[11] Zhou J , Mulshine JL, Unsworth FJ, et al . Purification and characterization of a protein that perm it s earl y detect ion of lung cancer [ J] . J Biol Chem, 2007, 271( 18) : 10760-10766.

[12] Gidenon D,Michael J,Matunis J, et al. Hn RNP proteins and the biogensi of mRNA[ J] .Annu Rev Biochem, 2003, 62: 289-321.

[13] Schenkel J, Sekeris CE,Alonso A, et al . RNA-binding properties of hnRNP proteins[ J] . Eur J Biochem, 2008, 171( 3) : 565-569.

[14] Erlitzki R, Fry M. Sequence-specific binding protein of s ingle-stranded and unimolecular quadruples telo meric DNA from rat hepatocytes[ J] . J Biol Chem, 2007, 272( 25) : 15881-15890.

[15] Kamma H, Fujimoto M, Fujiwara M, et al. Interaction of hnRNR A2/ B1 is oforms with telomeric ssDNA and the in vitro function[ J] . Biochem Biophys Res Commun, 2007, 280(3) : 625-630.

[16] Mckay SJ, Cooke H. hnRNP A2/ B1 binds specifically to single stranded vertebrate telomeric repeat TTAGGGn [ J] . Nucleic Acids Res, 2002, 20( 24) : 6461-6464.

[17] Mizukami K, Kamma H, Ishikawa M, et al . Immunohis tochemical study of the hnRNP A2 and B1 in the rat forebrain[ J] .Neuroreport , 2000, 11( 14) :3099-3102.

[18] Montuenga LM, Zhou J,Avis I, et al. Expression of heterogeneous nuclear ribo nucleoprotein A2/ B1 changes with critical stages of mammalian lung development [ J] .Am J Respir Cell Mol Biol, 2008, 19( 4) : 554-562.

[19] Kozu T, Henrich B, Schafer KP. Struc true and expression of the gene (HNRP A2/ B1) encoding the human hnRNP protein A2/ B1 [ J] . Genomics, 2005, 25( 2) : 365-371.

[20] Kamma H, Satoh H, Matusi M, et al. Characterization of hnRNP A2 and B1 using monoclonal at i bodies: intracellular distribution and metabolism through cell cycle[J] . Immunol Lett , 2001, 76( 1) : 49-54.

[21] Kamma H, Horiguchi H, Wan L, et al. Molecular characterization of the hnRNP A2/ B1 proteins: tissue-specific express ion and novel is oforms [J] .Exp Cell Res, 2006, 246( 2) : 399-411.

[ 22] Kamma H，Fujimoto M，Fujiwara M，et al. Interaction of hnRNP A2 /B1 isoforms with telomeric ssDNA and the function[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2011， 280 (3) : 625-630.

[23] Kamma H, Fujmoto M. Interaction of hnRNPA2 / B1 isoformer with telomeric ssRNA and the in vitro function [J]. Biophys Res Commun, 2008,280(3):625-630.

[24] Zhou J, Nong L, Wolch M, et al. Expression of early lung cancer detection marker: hnRNPA2 / B1, and its relation to microsatellite alteration in non-small cell lung cancer [J].Lung Cancer,2010 34(3):341-350.

[25] Pino I,Pio R, Toledo G, et al. Altered patterns of expression of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) family in lung cancer [J].Lung Cancer,2003,41(2):131-143.

Study on the expression of hnRNP A2/B1 and its effect on apoptosis in breast cancer

LiuShu,WangLan,WuPeixin.

GuiyangMaternalandChildren'sHealth-CareHospital.Guiyang550003,China.

Objective To detect the expression of hnRNP A2/B1 in breast cancer tissue and to investigate the effect of hnRNP A2/B1 on apoptosis of breast cancer cell line MCF-7. Methods 40 breast cancer tissue samples were from Guiyang Maternal and Children's Health-Care Hospital from January, 2005 to January, 2009. 20 breast fibroadenoma tissue samples were used as control. The expression of hnRNP A2/B1 in breast cancer was detected by Immunohistochemistry (IHC). hnRNP A2/B1 siRNA was transfected into breast cancer cell line MCF-7. Apoptosis of MCF-7 was investigated using TUNEL. Results 36 of 40 breast cancer tissue samples were positive for the expression of hnRNP A2/B1, while only 3 of 20 breast fibroadenoma tissue samples were positive. There were statistical significantly differences on hnRNP A2/B1 expression between breast cancer and breast fibroadenoma (P<0.01). After hnRNP A2/B1 siRNA was transfected into breast cancer cell line MCF-7, the apoptosis of MCF-7 cells was significantly increased. Conclusion hnRNP A2/B1 is highly expressed in breast cancer than that in breast fibroadenoma. Transfection with hnRNP A2/B1 siRNA can promote the apoptosis of breast cancer cells.

Breast cancer cell; hnRNP A2/B1; Apoptosis

R-33；R73-3

A

1000-744X(2016)02-0123-04

2015-11-12)