染料木素對脂多糖誘導的人單核細胞與主動脈內皮細胞黏附的影響

周雪冰 姜念 陸紅玲 歐剛衛

(遵義醫學院生物化學教研室，貴州 遵義 563003)

染料木素對脂多糖誘導的人單核細胞與主動脈內皮細胞黏附的影響

周雪冰 姜念 陸紅玲 歐剛衛△

(遵義醫學院生物化學教研室，貴州 遵義 563003)

目的 探討染料木素對脂多糖(LPS)同時誘導的人單核細胞(THP-1)與人主動脈內皮細胞(HAEC)黏附的影響作用。 方法 分別培養THP-1細胞與HAEC細胞，用不同濃度染料木素預處理兩種細胞30 min，然后用LPS同時誘導兩種細胞4 h，將THP-1細胞加入到HAEC細胞中共培養1 h，用孟加拉玫瑰紅法檢測THP-1細胞與HAEC細胞黏附情況；用酶聯免疫吸附法檢測細胞培養液上清中血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的濃度。結果 LPS能促使THP-1細胞與HAEC細胞黏附，促進 VCAM-1和ICAM-1釋放；加入染料木素后，兩種細胞的黏附量及VCAM-1和ICAM-1的釋放呈濃度依賴性減少(P<0.05)。結論 染料木素對脂多糖同時誘導的THP-1細胞與HAEC細胞的黏附有抑制作用。

染料木素； 脂多糖； 人單核細胞； 人主動脈內皮細胞； 黏附

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是一個慢性炎癥過程[1]。在As的發病機制中，一個關鍵的早期事件是炎性因子誘導的內皮細胞直接損傷，使其分泌大量炎性介質，導致單核細胞與內皮細胞相互黏附，隨后轉移到內皮下[2]。此外，炎性因子還可激活單核細胞，使其釋放多種細胞因子間接激活內皮細胞，誘導其表面多種黏附因子表達增強，引起內皮細胞間接損傷，最終導致As的發生和發展[3]。染料木素是一種來源于豆科植物的天然生物活性物質，在過去十年中,由于其具有多種生物學活性而引起廣泛的關注。研究發現，染料木素具有抑制脂質過氧化、抗炎、保護心血管等作用[4-6]。但目前的研究都僅局限于染料木素對單獨培養的內皮細胞的作用，而關于與單核細胞共存體系中內皮細胞的功能狀態報道較少。本實驗通過建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)同時誘導的人單核細胞(THP-1)與人主動脈內皮細胞(human aortic endothelial cell，HAEC)炎癥損傷并共培養的細胞模型，探討染料木素對共培養條件下THP-1細胞與HAEC細胞黏附的影響，以及血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的激活和表達情況，為進一步闡明染料木素的抗As機制提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LPS購自美國sigma公司；人ICAM-1及VCAM-1定量 ELISA試劑盒購自北京誠林生物科技有限公司；孟加拉玫瑰紅試劑購自北京索萊寶科技有限公司；染料木素購自美國sigma公司，用DMSO溶解配置成母液后儲存于-20 ℃備用，使用時以無血清培養基稀釋到所需濃度，DMSO終濃度為0.5%。

1.2 細胞來源及培養

HAEC細胞購自美國ATCC細胞庫，THP-1細胞購自上海細胞庫，兩種細胞均由含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養，培養環境為含5%CO2、37 ℃的培養箱，取狀態良好、處于對數期的細胞用于以下實驗。

1.3 實驗分組

實驗分為五組：(1)對照組，含無血清培養基；(2)LPS組，用100 ng/mL的LPS分別處理兩種細胞4 h；(3)不同濃度染料木素組：高劑量染料木素組(GH)、中劑量染料木素組(GM)、低劑量染料木素組(GL)，將染料木素各組分別加入100 μmol/L、10 μmol/L、0.1 μmol/L的染料木素作用30 min后，再與100 ng/mL的LPS作用4 h。

1.4 孟加拉玫瑰紅法[7]檢測THP-1細胞與HAEC細胞的黏附情況

取生長狀態良好的對數期HAEC細胞種于96孔板中，每孔1×104個，培養24 h。待細胞貼壁后，棄去舊培養基，用PBS清洗1次，按上述實驗分組加入不同濃度(100 μmol/L、10 μmol/L、0.1 μmol/L)的染料木素培養液100 μL/孔，置于培養箱中孵育30 min，吸棄原培養基，加入100 ng/mL的LPS繼續培養4 h；同時，選取生長狀態良好的THP-1細胞用無血清培養基種于另一96孔板內，每孔3×104個，同樣按照要求，加入不同濃度染料木素處理細胞并置于培養箱中孵育30 min后，吸棄原培養基，加入100 ng/mL的LPS繼續培養4 h。另設單加空白培養基組以及單加100 ng/mL的LPS組作為對照組。待兩種細胞分別孵育4 h后，將THP-1細胞加入到HAEC細胞中，再置培養箱中共孵育1 h。棄原培養基，用無菌PBS每孔清洗1次，去除未黏附的THP-1，每孔加入100 μL 0.25%的孟加拉玫瑰紅反應液，室溫作用5 min，吸棄染料，用無菌PBS每孔清洗2次，加入終止液(PBS∶無水乙醇=1∶1)200 μL/孔，室溫作用30 min后，酶標儀在490 nm波長處測定各孔的光密度值(A值)，A值越大代表黏附量越多。

1.5 酶聯免疫分析法(ELISA)檢測細胞培養液中VCAM-1、ICAM-1的釋放

將HAEC細胞種于24孔板中，每孔10×104個，培養24 h。待細胞貼壁后，棄去舊培養基，用PBS清洗1次，按上述實驗分組加入不同濃度(100 μmol/L、10 μmol/L、0.1 μmol/L)染料木素培養液500 μL/孔，置于培養箱中孵育30 min，吸棄原培養基，加入100 ng/mL的LPS繼續培養4 h；同時，選取生長狀態良好的THP-1細胞用無血清培養基種于另一96孔板內，每孔3×104個，同樣按照要求，加入不同濃度染料木素處理細胞并置于培養箱中孵育30 min后，吸棄原培養基，加入100 ng/mL的LPS繼續培養4 h。另設單加空白培養基組以及單加100 ng/mL的LPS組作為對照組。待兩種細胞分別孵育4 h后，將THP-1細胞加入到HAEC細胞中，再置培養箱中共孵育1 h。將細胞培養液收集至干凈離心管中2 500 r/min離心20 min，再吸取上清液至干凈EP管中備用，按ELISA試劑盒的檢測步驟逐步操作。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 不同濃度LPS同時誘導THP-1細胞與HAEC細胞黏附的影響

用10ng/mL、100ng/mL及1μg/mLLPS分別刺激THP-1細胞、HAEC細胞4h后，發現應用100ng/mLLPS刺激細胞黏附最顯著，見表1、圖1。因此后續試驗選擇100ng/mLLPS作用細胞。

分 組 THP-1細胞與HAEC細胞黏附(A490) 空白對照組0.139±0.22810ng/mL0.154±0224100ng/mL0.226±0.036*1μg/mLLPS0.175±0.039

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

圖1 不同濃度LPS對THP-1細胞及HAEC細胞黏附的影響

2.2 染料木素對LPS同時誘導的THP-1細胞與HAEC細胞黏附的影響

兩種細胞分別加入100ng/mLLPS刺激前30min加入不同濃度染料木素預處理后，與單用LPS組比較，隨著染料木素濃度的增加，兩種細胞的黏附量逐漸減少(P<0.05)。見表2、圖2。

分 組THP-1細胞與HAEC細胞黏附(A490)對照組0.162±0.006*LPS0.254±0.020GL0.241±0.020GM0.200±0.019*GH0.174±0.007*

注：與LPS組比較，*P<0.05。

圖2 不同濃度染料木素對LPS同時誘導的THP-1細胞與HAEC細胞黏附的影響

2.3 應用ELISA檢測細胞培養上清液中VCAM-1、ICAM-1的含量

與對照組比較，應用LPS同時處理兩種細胞4h后，能顯著增加細胞培養上清液中VCAM-1、ICAM-1的含量(P<0.01)，與LPS組比較，染料木素呈濃度依賴性地抑制LPS誘導的細胞培養上清液中VCAM-1、ICAM-1的釋放。見表3。

分組VCAM-1(μg/L)ICAM-1(ng/L)對照組 786±124**605±79.92**LPS組1116±13.71788±36.16GL組962±92.35**768±20.80GM組840±37.49**699±6.52*GH組804±51.20**628±52.15**

注：與LPS組比較,*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

大多數研究認為，As從發生發展到轉歸的全過程就是一個慢性的炎癥過程，眾多炎癥細胞和炎癥介質參與其中[8-9]。高血脂、糖尿病、細菌和病毒感染等動脈粥樣硬化危險因素均可刺激血管內皮細胞，促進動脈粥樣硬化的形成和發展。其中，微生物感染是As發生發展的協同誘發因素之一。LPS作為一種強烈的炎癥啟動因子可誘導血管內皮細胞損傷，其表達的黏附分子和化學誘導物能促進炎性單核細胞黏附到血管壁而加劇內皮細胞的損傷，引發As的病理生理改變[10-11]。并且LPS還可通過激活單核細胞，使其釋放多種細胞因子，引起內皮細胞的間接損傷。血液中的炎性細胞與血管內皮黏附是As早期啟動的關鍵。血液中單核-巨噬細胞與內皮細胞的黏附是前者進入血管壁的前提，而活化的血管內皮細胞黏附分子的高表達是誘導炎性細胞向血管壁黏附和浸潤的分子基礎。本研究發現，致炎因子LPS能夠促進THP-1細胞與HAEC細胞的黏附，且在100ng/mL時作用明顯，這與張振等的報道一致。

染料木素又被稱為染料木黃酮、金雀異黃素，它具有弱的雌激素效應，在藥理劑量時是一個著名的非特異性酪氨酸激酶抑制劑[12]。現有研究表明，染料木素具有抑制脂質過氧化、抗炎、保護心血管等作用。本研究發現，LPS能夠促進THP-1細胞與HAEC細胞黏附，而染料木素能夠有效抑制LPS誘導的THP-1細胞與HAEC細胞黏附，提示染料木素對單核細胞以及內皮細胞的炎癥損傷有一定保護作用。

有研究顯示，載脂蛋白E缺陷的小鼠血管內皮易于發生粥樣硬化的部位，其VCAM-1、ICAM-1 的表達上調；如將小鼠的單核趨化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1，MCP-1 )或VCAM-1 基因敲除，其粥樣硬化病變則明顯減少，提示趨化因子或細胞黏附分子在動脈粥樣硬化的發生發展中起重要作用。而ICAM-1、VCAM-1可促進炎性細胞尤其是單核細胞的遷移與浸潤，可吸引大量單核細胞進入內皮下成為泡沫細胞而促進As的發生、發展[13]。本研究發現，經LPS作用后，與對照組相比，細胞培養液中ICAM-1和VCAM-1的含量明顯增加。推測LPS可通過激活培養細胞釋放黏附分子，促進兩種細胞的黏附；而加入染料木素后能夠顯著抑制LPS同時誘導的兩種細胞釋放ICAM-1和VCAM-1，且其作用呈濃度依賴性。

綜上所述，染料木素能夠通過下調ICAM-1和VCAM-1的表達，有效抑制LPS同時誘導的THP-1細胞與HAEC細胞的黏附，這為臨床研制預防和治療動脈粥樣硬化的藥物提供了依據。但其作用機制有待進一步探討。

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Effect of genistein on the adhesion of monocytes and endothelial cells induced by lipopolysaccharide

ZhouXuebing,JiangNian,LuHongling,OuGangwei,

DepartmentofBiochemistry,ZunyiMedicalUniversity,Zunyi563003,China.

Objective To investigate the effect of genistein on the adhesion of monocytes and endothelial cells induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods After human monocytes (THP-1) and human aortic endothelial cells (HAEC) were pretreated with genistein for 30 minutes and then induced with LPS for 4 hours respectively, the THP-1 cells were co-cultured with the HAEC cells for 1 hours. The adhesion between THP-1 and HAEC was detected by Rose Bengal, and the protein expression levels of ICAM-1 and VCAM-1 in the supernatant of the cultured cells were detected by ELISA. Results The adhesion effect between THP-1 and HAEC was increased significantly and the secretion of VCAM-1 and ICAM-1 was raised when the two cell lines were treated by LPS for 4 hours respectively. After administrating with genistein, both the adhesion rate of two cell lines and expression levels of VCAM-1 and ICAM-1 were reduced in a concentration-dependent manner. Conclusion Genistein can inhibite the adhesion effect of monocytes to endothelial cells induced by LPS.

Genistein; Lipopolysaccharide; Human monocytes； Human aortic endothelial cells； Adhesion

貴州省科技廳聯合基金重點項目資助課題[黔科合J字LKZ(2013)14]

R-33

A

1000-744X(2016)02-0127-04

2015-07-16)

△通信作者