DNA-PKcs影響肝癌耐藥細胞Bel-7402/5-Fu增殖及機制的研究

李大玉 余春波 束波 生欣 李長福 范芳

(遵義醫學院生物化學教研室，貴州 遵義 563099)

DNA-PKcs影響肝癌耐藥細胞Bel-7402/5-Fu增殖及機制的研究

李大玉 余春波 束波 生欣 李長福 范芳△

(遵義醫學院生物化學教研室，貴州 遵義 563099)

目的 檢測DNA-PKcs對肝癌耐藥細胞Bel-7402/5-Fu增殖的影響及其相關機制，探討DNA-PKcs在肝癌多藥耐藥的發生發展中的作用。方法 采用陽離子脂質體法將siDNA-PKcs轉染Bel-7402/5-Fu細胞，cck-8法檢測細胞增殖情況；流式細胞技術檢測細胞周期；Western blot檢測DNA-PKcs、TS蛋白的表達情況。結果 實驗組與對照組比較，細胞增殖減少(P<0.05)；實驗組S期細胞與對照組比較，細胞數減少(P<0.05)；DNA-PKcs、TS蛋白表達結果顯示，實驗組相比對照組蛋白表達下調，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 DNA-PKcs的表達沉默能抑制肝癌耐藥細胞Bel-7402/5-Fu的細胞增殖；其機制可能與沉默DNA-PKcs蛋白表達后， TS蛋白表達下調有關。

DNA依賴蛋白激酶催化亞基； Bel-7402/5-Fu； 細胞增殖； 機制

肝細胞癌是臨床常見的消化系統惡性腫瘤之一，其起病隱匿，侵襲性強，復發率高的特點決定了化療在綜合治療中有重要作用，但多藥耐藥是致使化療失敗的重要原因。DNA依賴蛋白激酶催化亞基(catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase,DNA-PKcs)是DNA依賴蛋白酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)的催化亞單位，參與許多細胞內重要的生物學活動，包括細胞凋亡信號傳導、免疫細胞V(D)J重組、免疫細胞分化、基因重組性監視、穩定端粒結構和防止染色體末端融合等[1]。目前關于DNA-PKcs在影響腫瘤耐藥的發生發展過程中確切的作用機制和功能還未清楚，現有研究表明DNA-PKcs與肝癌的耐藥有關[2]。本研究以siDNA-PKcs轉染 Bel-7402/5-Fu肝癌耐藥細胞，檢測DNA-PKcs沉默后對肝癌耐藥細胞Bel-7402/5-Fu增殖能力的影響，探討DNA-PKcs在肝癌耐藥的發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

Bel-7402/5-Fu細胞株購于南京凱基生物科技發展有限公司；siRNA寡核苷酸購于上海吉瑪基因生物技術有限公司；Lipofectamine○R2000 Reagent購買于Invitrogen公司；CCK-8檢測試劑盒購于美國PeproTech公司；碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)購于凱基生物技術有限公司；DNA-PKcs抗體購買于Assay biotech公司；TS抗體購買于proteintech公司。其它試劑為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將Bel-7402/ 5-Fu細胞培養在含有10%的胎牛血清的1640培養液中，置于37 ℃、5%的二氧化碳培養箱中培養。每天觀察細胞生長狀態，取對數期細胞用于實驗。

1.2.2 分組與轉染 分為空白對照組、NC對照組、siDNA-PKcs實驗組。細胞接種于培養板中，96孔板按5000個/孔，六孔板按5×105個/孔，融合度達到60%～80%時進行轉染。配制siRNA-脂質體復合物，并加入對應孔中，4～6 h換液。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖 取對數生長期細胞，首先制備成細胞懸液并計數，按5 000個/孔接種于96孔板中，共3塊板，分別標明24 h、48 h、72 h，16 h后轉染細胞，5 h后棄培養基，按各個時間點，每孔加入10 μL的cck-8，繼續培養4 h后，490 nm波長測定其吸光度值。用Graphpad prism5.0軟件分析細胞增殖情況。

1.2.4 流式細胞技術檢測細胞周期 將細胞接種于6孔板中，12 h后用無血清培養基培養細胞12 h，細胞同步化處理后進行轉染，5 h后換液，用含100 ug/mL 5-Fu 的培養基進行培養，48 h后收集細胞，PI單染，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.5 Western blot檢測DNA-PKcs、TS蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，BCA法定量樣品蛋白含量。SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%BSA封閉1.5 h，一抗孵育過夜(4 ℃)，TBST洗膜3次，二抗孵育2 h(室溫),TBST洗膜3次，ECL發光顯色，用ImageJ定量分析軟件分析灰度比。

1.3 統計學處理

數據分析采用 Graphpad prism5.0軟件包，實驗數據以均值±標準差(mean±SD)表示。多組間的均數比較采用單因素方差分析，P<0.05示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CCK-8法檢測細胞增殖

結果顯示，在細胞轉染siDNA-PKcs后，細胞培養24 h、48 h、72 h，對照組間細胞增殖無明顯差異(P>0.05)；實驗組與對照組比較，細胞增殖減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

Groups24h48h72h空白對照組0.352±0.0230.578±0.0250.913±0.106NC對照組0.321±0.0150.561±0.0600.983±0.051siDNA-PKcs實驗組0.227±0.0080.419±0.0270.526±0.023

注：*P <0.05；** P <0.01。圖1 各組細胞在24h、48h、72h增殖情況

2.2 Western blot檢測DNA-PKcs、TS的蛋白表達情況

結果顯示，實驗組DNA-PKcs和TS蛋白表達下調，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

注：1為空白對照組；2為NC對照組；3為siDNA-PKcs實驗組；*P<0.01。圖2 各組細胞DNA-PKcs、TS蛋白表達情況

2.3 流式細胞技術檢測細胞周期

結果顯示，轉染siDNA-PKcs實驗組與對照組比較， S期細胞數量減少，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

注：A為空白對照組；B為NC對照組；C為siDNA-PKcs實驗組；*P<0.01。圖3 流式細胞技術檢測各組細胞周期情況

3 討 論

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤，目前常用手術結合放療和化療，但長期放化療后容易出現多藥耐藥，這可能與細胞DNA損傷修復能力增強和DNA合成能力有關。然而，臨床很多化療藥物均會引起DNA損傷，從而阻礙DNA的生物合成。在哺乳動物細胞中，以DNA依賴蛋白酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)為核心組件的非同源重組修復 (non-homologous end joining，NHEJ)途徑，在DNA雙鏈斷裂的修復中有著非常重要的作用[3-4]。

DNA-PKcs是DNA-PK的催化亞單位，位于染色體8ql1上，相對分子量為470kD，主要包括DNA斷裂結合區、催化功能區、Ku結合區三個功能區，屬于PI3K(phosphatidylinositol3-kinases，PI3K)家族[5-6]。DNA-PKcs能維持基因組的穩定性并具有腫瘤抑制功能[7]。目前有研究表明，下調DNA-PKcs表達能增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[8]。在一些耐藥細胞中發現DNA-PKcs表達和活性增加[9-10]，說明DNA-PKcs可能會促進某些腫瘤細胞耐藥。另有研究表明，DNA-PKcs 能通過 AKT/GSK3 /c-myc途徑 , 調節細胞增殖[11]。胸苷酸合成酶(TS)是 DNA生物合成所必需的，因此，抑制TS就能抑制DNA的生物合成，進而抑制細胞生長、增殖[12]。本實驗已通過沉默DNA-PKcs發現耐藥蛋白P-gp表達降低和DNA合成減少，因此推測耐藥細胞Bel-7402/5-Fu耐藥性降低可能與DNA-PKcs沉默所致的P-gp下調和DNA合成減少有關(已發表)。原因可能是DNA-PKcs介入肝癌耐藥細胞Bel-7402/5-Fu DNA損傷修復系統和細胞DNA的生物合成，從而調控細胞的增殖。DNA-PKcs在某些耐藥細胞中表達增加和活性增強，增加了耐藥細胞DNA損傷修復的能力，從而能對抗化療藥物所致的DNA損傷而引起耐藥，促進細胞增殖。本實驗采用RNAi技術沉默DNA-PKcs的表達，cck-8法檢測細胞的增殖能力，結果顯示細胞增殖能力減弱。為更進一步說明沉默DNA-PKcs后能抑制細胞增殖，本實驗還檢測了細胞周期，結果發現S期細胞減少，推測沉默DNA-PKcs后抑制細胞增殖可能是通過影響細胞DNA合成，從而影響其細胞增殖能力。所以，本實驗進一步檢測肝癌耐藥細胞Bel-7402/5-Fu中TS蛋白的表達情況，結果顯示沉默DNA-PKcs后肝癌耐藥細胞Bel-7402/5-Fu中TS蛋白表達明顯降低，說明DNA-PKcs沉默能影響細胞增殖，其機制與DNA-PKcs表達沉默后下調TS蛋白的表達有關。DNA-PKcs是否還通過其它機制調控肝癌耐藥細胞的細胞增殖，有待進一步的實驗觀察。

[1] Someya M，Sakata K，Matsumoto Y，et al. The association of DNA-dependent protein kinase activity with chromosomal instability and risk of cancer[J]. Carcinogenesis，2006， 27 (1)：117-122.

[2] 梁大敏，束波，楊佳偉，等.shRNA沉默DNA-PKcs表達對肝癌耐藥細胞BEL7402/5-FU耐藥性的影響[J]. 遵義醫學院學報，2014,37(3)：304-307.

[3] Curtin NJ.DNA repair dysregulation from cancer driver to therapeutic target[J].Nat Rev Cancer,2012，12(12):801-817.

[4] Rothkamm K, Krüger I, Thompson LH, et al. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle[J].Mol Cell Biol， 2003，23:5706-5715.

[5] Woods DS,Sears CR,Turchi JJ. Recognition of DNA termini by the C-terminal region of the ku80 and the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit[J].Plos One.2015，10(5):1-19.

[6] Gareth J， Williams, Michal Hammel,et al. Structural insights into NHEJ: building up an integrated picture of the dynamic DSB repair super complex, one component and interaction at a time[J]. DNA Repair (Amst)，2014，17: 110-120.

[7] 江娜,沈瑛,孔憲明,等.DNA-PK蛋白功能及其調控機制[J].醫學分子生物學雜志, 2011，8(3):278-282.

[8] Seo SB, Hur JG, Kim MJ, et al.TRAIL sensitize MDR cells to MDR-related drugs by down-regulation of P-glycoprotein through inhibition of DNA-PKcs/Akt/GSK-3beta pathway and activation of caspases[J].Mol Cancer,2010， 28(9):199.

[9] Ryu JS,Um JH,Kang CD, et al. Fractionated irradiation leads to restoration of drug sensitivity in MDR cells that correlates with down-regulation of P-gp and DNA-dependent protein kinase activity[J]. Radiat Res，2004 ，162(5):527-535

[10] Nishida Y,Mizutani N,Inoue M , et al. Phosphorylated Sp1 is the regulator of DNA-PKcs and DNA ligase IV transcription of daunorubicin-resistant leukemia cell lines[J].Biochim Biophys Acta，2014，1839(4):265-274.

[11] 黃越承,周平坤, 蔡建明,等. 肝癌及不同發育階段小鼠肝組織中 DNA-PKcs 的表達及其對細胞增殖作用的研究[J]. 第二軍醫大學學報,2009,30(11):1217-1220.

[12] 高國蘭，萬紅英，黃傳生,等. P-gP、GST-π、TS蛋白在宮頸癌中的表達及臨床意義[J].臨床腫瘤學雜志，2007,12(1)：23-26.

Study on the effect of DNA-PKcs on the proliferation and the mechanism of the multidrug-resistant hepatocellular
carcinoma cell line Bel7402/5-Fu

LiDayu,YuChunbo，ShuBo,ShengXin，LiChangfu,FanFang.

DepartmentofBiochemistry,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.

Objective To detect the effect of DNA-PKcs on the proliferation of and its mechanism of the multidrug-resistant hepatocellular carcinoma cell line Bel7402/5-Fu, and to investigate the role of DNA-PKcs in the development of multidrug resistance. Methods Transiently was transfected into Bel7402/5-Fu cells via cathodolyte liposome transfection method，and cell proliferation was detected by CCK-8 assay. The cell cycle was detected by flow cytometry. Western blot (WB) tested protein expression of DNA-PKcs and TS. Results CCK-8 results showed that the experimental group compared with the control group, the cell proliferation was cells in the experimental group was decreased (P<0.05) compared with the control group. WB detection of DNA-PKcs and TS protein expression showed decreased expression of the experimental group than the control group (P<0.05), and there were statistical significantly differences. Conclusion The silence of DNA-PKcs can inhibit decreased (P<0.05). The results of flow cytometry showed that the number of S phase Bel7402 / 5-Fu cell proliferation, and possible mechanism of silencing DNA-PKcs expression after down-regulation of TS protein expression.

DNA-PKcs； Bel7402/5-Fu Cell proliferation; Mechanism

貴州省社發攻關項目[No.(2009)3066]

R-33

A

1000-744X(2016)02-0131-04

2015-09-19)

△通信作者，E-mail:fanf1970@126.com