清解益肺湯及膠囊對lewis肺癌小鼠血清IL-2、INF-含量的影響

劉煒 易鑫 李江 王江江

(1.貴陽中醫學院第二附屬醫院，貴州 貴陽 550003；2.貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002)

清解益肺湯及膠囊對lewis肺癌小鼠血清IL-2、INF-含量的影響

劉煒1易鑫2李江2王江江2

(1.貴陽中醫學院第二附屬醫院，貴州 貴陽 550003；2.貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002)

目的 研究清解益肺湯及膠囊劑對lewis肺癌小鼠脾臟指數以及血清白介素-2(IL-2)、γ-干擾素(INF-)水平的影響。方法 建立C57BL/6J雄性小鼠lewis肺癌模型，并隨機分為空白對照組，模型對照組，中藥高、中、低劑量組，順鉑組，順鉑+中劑量組，中藥膠囊組，每組10只，連續給藥14 d 。觀察lewis肺癌小鼠脾臟指數：采用ELISA法檢測小鼠血清中IL-2、INF-γ的含量。結果 順鉑組與模型組相比較脾臟指數降低(P<0.05)，聯合組以及中藥各組脾臟指數均增加(P<0.05)；聯合組與順鉑組比較脾臟指數增加(P<0.05)；與模型組相比較各中藥組IL-2、INF-含量均增加(P<0.05)。結論 清解益肺湯及膠囊能提高肺癌小鼠脾臟指數，并能一定程度解除化療對機體的免疫抑制作用，通過上調血清IL-2、INF-水平來增強T細胞介導的細胞免疫功能，發揮抗肺癌作用。

清解益肺湯及膠囊劑； lewis肺癌； 白介素-2(IL-2)；γ-干擾素(INF-)

肺癌是當今世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)約占全部肺癌的80%～85%，并且大部分患者就診時己屬中晚期(Ⅲ-Ⅳ期)[1]。多項臨床研究證實，對于肺癌患者其細胞免疫功能會受到不同程度抑制，從而造成腫瘤的轉移、復發。肺癌患者體內常表現為免疫功能抑制狀態[2]，臨床上多表現為氣陰兩虛型，中藥復方特別是益氣養陰復方多具有改善免疫功能作用。清解益肺湯是基于苗族傳統的用藥經驗，并結合中醫方劑理論中清熱解毒、益氣養陰的治法而成，全方由白花蛇舌草、半枝蓮、龍葵、黃芪、沙參、薏苡仁、莪術七味中藥組成，主要適用于氣陰兩虛型中晚期肺癌，其湯劑已經過大量臨床病例證實其安全性和有效性[3]。本課題采用C57BL/6J雄性小鼠lewis肺癌模型，觀察清解益肺湯及膠囊對lewis肺癌小鼠血清IL-2、INF-γ水平的影響，初步闡明其抗肺癌的作用及免疫學機理。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6J雄性小鼠，SPF級，體質量18～20 g(第三軍醫大學實驗動物中心)，動物合格證號：SCXK(軍)2012-0011；實驗動物飼養環境：貴陽中醫學院實驗動物中心。細胞株：小鼠lewis肺癌細胞珠(LLC)，來自ATCC細胞庫(細胞編號：CRT-1642)。

1.2 藥物及試劑

清解益肺湯(黃芪30 g、沙參30 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g、薏苡仁15 g、莪術10 g、龍葵15 g)，常規方法制成煎劑含生藥1.3 g/mL，根據給藥劑量和給藥體積配成相應濃度。清解益肺膠囊(貴陽中醫學院生藥制劑室提供，規格：含生藥1.3 g/mL)。順鉑(DDP，20 mg/支)(國藥準字：H20030675，產品批號：20131013，南京制藥廠有限公司)。主要試劑：小鼠IL-2 ELISA試劑盒、小鼠INF-ELISA試劑盒(美國RD公司產品)，Hyclone胎牛血清(批號：SV30087.01)。

1.3 儀器

超凈工作臺、酶標儀(北京新風ZS-3型)、8聯排移液器(BRAND)離心機(湘儀貝克TGL-20 M臺式高速冷凍離心機)、37℃恒溫箱(天津泰斯特202-2AB電熱恒溫箱)、自動洗板機(北京拓普DEM-3)、精密電子天平。

1.4 方法

lewis肺癌小鼠造模與分組：采用小鼠lewis肺癌移植瘤模型。無菌條件下選取生長良好的C57BL/6J荷瘤小鼠瘤組織，按瘤重∶生理鹽水1∶3比例制成瘤細胞懸液，用生理鹽水調整細胞濃度為1×107/mL，每只0.2 mL接種于除空白對照組外的其余各組小鼠右前腋窩皮下。并隨機分為：空白對照組，模型對照組，中藥高、中、低劑量組，順鉑陽性組，順鉑+中劑量組，中藥膠囊組。接種瘤細胞24 h后開始給藥，空白對照組，模型對照組：均予滅菌生理鹽水0.4 mL灌胃，1次/d，連續給生理鹽水14 d；中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組：分別灌胃含生藥2.6 g/mL、1.3 g/mL、0.65 g/mL的藥液0.4 mL，1次/d，連續給藥14 d；中藥膠囊組：1.3 g/mL生藥濃度灌胃，0.4 mL/只，1次/d，連續給藥14 d；中劑量+順鉑組：1.3 g/mL濃度中藥0.4 mL灌胃，1次/d，連續給藥14 d，順鉑0.3 mL腹腔注射，1次/隔日；順鉑陽性組：按每只2 mg/kg·d-1劑量給藥，用生理鹽水稀釋成0.2 mg/mL濃度，0.3 mL腹腔注射，1次/隔日。于末次給藥24 h后處死小鼠，進行檢測。

1.5 觀察指標

(1)荷瘤小鼠脾臟指數測定：末次給藥24 h后脫頸處死小鼠，無菌摘取小鼠脾臟，迅速于精密電子分析天平上稱重，計算各組小鼠脾臟指數。計算公式：脾臟指數=脾臟重量(mg)/體質量(g)。(2)ELISA法檢測各組lewis肺癌小鼠血清IL-2、INF-γ水平：摘取小鼠眼球留取血液，全部血液標本靜置30 min后，放入離心機中，2 000 rpm離心15 min，收集上清液置于-80℃低溫冰箱保存。取出小鼠IL-2、INF-ELISA試劑盒嚴格按照說明書進行操作，用OD450檢測，繪制標準曲線，各組樣本的IL-2、INF-含量根據OD值由標準曲線得出相應濃度。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 清解益肺湯及膠囊對lewis肺癌小鼠脾臟指數的影響

順鉑組與模型組相比較脾臟指數降低(P<0.05)，聯合組以及中藥各組脾臟指數均增加(P<0.05),聯合組與順鉑組比較脾臟指數增加(P<0.05)。見表1。

組別只數脾臟指數(mg/g)空白對照組105.90±0.32模型對照組101.94±0.22中藥高劑量組105.30±0.31*中藥中劑量組104.86±0.52*中藥低劑量組103.16±0.37*順鉑陽性組81.38±0.26▽順鉑+中劑量組102.65±0.37*°中藥膠囊組105.42±0.63*

注：與模型組相比，▽P<0.05；與順鉑組相比，°P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

2.2 清解益肺湯及膠囊對lewis肺癌小鼠血清IL-2、INF-水平的影響

模型組小鼠血清IL-2、INF-含量明顯低于空白組；與模型組相比較各中藥組IL-2、INF-含量均增加(P<0.05)。見表2。

組別只數IL-2(pg/mL)INF-?(pg/mL)空白對照組10128.68±4.98*581.19±11.66*模型對照組1052.84±2.75▽211.13±14.41▽中藥高劑量組1097.29±3.47*476.73±10.38*中藥中劑量組1084.13±3.19*407.63±14.31*中藥低劑量組1074.27±2.84*344.87±10.1*順鉑陽性組834.53±2.94184.81±13.94順鉑+中劑量組1058.38±2.48*300.88±10.76*中藥膠囊組1096.44±3.61*469.41±12.22*

注：與空白組相比，▽P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

3 討 論

CD4+T細胞活化后可產生多種細胞因子，主要分為Th1和Th2兩個亞群，其中IL-2和INF-是Th1介導細胞免疫發揮機體免疫功能的兩個重要因子。IL-2是機體最主要、最強有力的T細胞生長因子，它是保障機體正常免疫功能的關鍵因素。IL-2抗腫瘤作用不是直接殺傷腫瘤細胞，主要通過誘導和激活免疫細胞殺傷腫瘤細胞，解除腫瘤浸潤淋巴細胞的免疫抑制狀態并增強其免疫功能。IL-2的水平是反映腫瘤免疫功能的一項重要指標．Neuner等[4]研究證實IL-2在NSCLC患者體內處于受抑制狀態，其表達可以作為非小細胞肺癌預后的重要因子。INF-可誘導Th1細胞分化，激活巨噬細胞，直接殺傷腫瘤細胞。IL-2能誘導殺傷細胞分泌INF-細胞因子，兩者協調增強機體免疫，發揮抗腫瘤作用。

本組資料結果顯示，清解益肺湯及膠囊能提高lewis肺癌小鼠免疫功能，并在一定程度上抑制化療導致的脾臟指數的下降，保護機體免疫能力，增強化療療效。清解益肺湯及膠囊能上調血清IL-2、INF-含量來增加Th1細胞因子表達，從而改善lewis肺癌小鼠T細胞介導的細胞免疫功能，發揮抗肺癌作用。清解益肺湯作為苗藥復方制劑，含有多種活性成分，其抗腫瘤作用機制，可能是多途徑，多靶點，本文只從細胞免疫方面初步探討了其抗腫瘤機制，后期我們還將進一步從其它途徑來研究該復方制劑，以期從苗醫藥領域探索新型抗腫瘤藥物。

[1] 中國抗癌協會肺癌專業委員會.2010中國肺癌臨床指南[S].北京：人民衛生出版社，2010：1.

[2]SimanG，GinsbergRJ，RuckdeschlJC.Small-celllungcancer[J].ChestSurgClinNAm，2001，11(1)：165-188．

[3] 劉煒.清解益肺湯治療老年晚期肺細胞肺癌56例療效觀察[J].醫學理論與實踐,2011，24(24)，2960-2961．

[4]NeunerA，SchindelM，WildenbergU，etal.Prognoslicsignificanceofcytokinemodulationinnon-small-celllungcancer[J]．IntJCancer，2002，101(3)：287-292．

The influence of Qingjieyifei decoction and capsule to the content of serum INF-γand IL-2 on lewis lung carcinoma in mice

LiuWei1,YiXin2,LIJiang2,WanJiangJiang2.

1.GuiyangCollegeofTraditionnalChineseMedicine,Guiyang550002,China.2.SecondHospitalAffiliatedtoGuiyangCollegeofTraditionnalChineseMedicine,Guiyang550003,China.

Objective To study the influence of Qingjieyifei decoction and capsule the content of serum INF-γ、IL-2 and spleen index on lewis lung carcinoma in mice .Methods: The male mouse model ofC57BL/6J was built to do the experiments. They were randomly divided into normal group, model group, the traditional Chinese medicine high, middle, low dose group, cisplatin group, cisplatin +middle dose group, Chinese medicine capsule dose. Each group were given medicine respectively.Observing spleen index and using the method of ELISA to detect the contents of serum IL-2、INF-γ. Results: Cisplatin group has lower spleen index compared with model group(P<0.05).Unions and traditional Chinese medicine groups have higher spleen index(P<0.05). Chinese medicine groups have higher contents of serum IL-2、INF-γcompared with model group(P<0.05). Conclusion: Qingjieyifei decoction and capsule can improve lung cancer in mice spleen index and to a certain extent to lift the immunosuppressive effect of chemotherapy ,on increase serum levels of IL-2, INF-γ to enhance cellular immune function of T cell mediated, play the anti-lung cancer effect.

Qingjieyifei decoction and capsule , lewis lung，IL-2，INF-γ

貴州省科學技術聯合基金項目[No：2010LKZ7005]

R-332

A

1000-744X(2016)02-0153-03

2015-07-16)